卵母细胞的成熟是一个及其复杂的过程，在进行减数分裂时往往伴随着细胞核的变化。为了更大程度地利用卵巢中的卵泡资源，获得较多数量的卵母细胞，将其进行体外成熟、体外受精或动物克隆等动物胚胎实验。本实验采用人工分捡的方法将未充分生长、未形成透明带的卵母细胞与颗粒细胞分离，再将所得细胞进行Hoechst染色。结果表明未形成透明带前卵母细胞可能为初级卵泡中的初级卵母细胞，数量丰富。大部分未形成透明带前卵母细胞具有两个细胞核，只有少数卵母细胞具有一个细胞核，差异极显著（75.54% vs. 24.46%, P<0.01）。因此，需要进一步实验研究。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1.1材料 3
1.1.1 猪卵巢 3
1.1.2 主要试剂 3
1.1.3 实验仪器 4
1.2 方法 4
1.2.1 卵泡液的收集 4
1.2.2 口吸管的制作 4
1.2.3 未形成透明带前卵母细胞的收集 4
1.2.4 Hoechst染色 4
1.2.5 数据分析 4
2 结果分析 4
2.1 未形成透明带前卵母细胞形态学观察 4
2.2 未形成透明带前卵母细胞数量统计 5
2.3 未形成透明带前卵母细胞Hoechst染色观察 5
2.4 未形成透明带前卵母细胞细胞核数量统计 6
3 讨论 7
致谢 9
参考文献 9
猪卵巢内未形成透明带前卵母细胞的状态分析
引言
引言：卵巢是雌性哺乳动物的生殖器官，具有分泌激素和排出成熟卵母细胞的功能。在哺乳动物的卵巢中，卵母细胞发育的基本功能单位是卵泡[1]。卵泡由一个卵母细胞及其周围的颗粒细胞和外层的卵泡膜细胞构成，其数量在出生前后就已经确定，不会在成年后发生变化[2]。卵巢中卵泡发育的过程十分复杂，经历了启动、募集、选择、优势化等过程，最终排出卵子，而排出的卵子是由少数优势卵泡中的卵母细胞发育而来的[ *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: @351916072@ 
3]。卵泡的发育起始于胎儿期，胎儿出生时卵巢中已经存在不同发育阶段的卵泡，哺乳动物进入性成熟期后卵泡开始生长发育，只有一个或数个成熟并排出，绝大多数的原始卵泡在发育到不同阶段后发生萎缩退化，形成闭锁卵泡[4]。根据卵泡的发育时期及形态和功能特征可分为原始卵泡、次级卵泡、三级卵泡和成熟卵泡。原始卵泡由停滞在减数第一次分裂前期的卵母细胞和周围包裹的单层扁平的颗粒细胞组成，是卵巢的基本单位，也是卵泡发育的起点[5]。原始卵泡被激活后，卵母细胞周围的颗粒细胞变为立方形，此时的卵泡发育为初级卵泡。随着初级卵泡发育为次级卵泡的过程，颗粒细胞通过有丝分裂的方式进行增殖，形成多层颗粒细胞并围绕着初级卵母细胞，在卵泡生长发育的同时，卵泡中的初级卵母细胞直径也随之增大，生发泡（Germinal vesicle, GV）变大，并进入转录十分活跃的网状期，初级卵母细胞的周围出现了透明带。随着卵母细胞及其周围颗粒细胞的生长发育，次级卵泡进一步发育成为三级卵泡，其特征是出现卵泡液并形成卵泡腔[6]。成熟卵泡是发育到最后阶段的卵泡，卵泡腔增大，形成卵丘，卵泡体积显著增大，最终突出于卵巢表面[7]。因此原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡为腔前卵泡，三级卵泡和成熟卵泡为有腔卵泡。直到排卵前，卵泡中的初级卵母细胞完成减数第一次分裂，形成次级卵母细胞并排出第一极体。
在哺乳动物的胎儿时期，原始生殖细胞到达性腺后分化成卵原细胞，只有一小部分卵原细胞经过有丝分裂增殖分化形成初级卵母细胞[8]。初级卵母细胞经细线期、偶线期、粗线期，同源染色体发生联会和重组后[9]，卵母细胞最终停留在第一次减数分裂前期的双线期，此时卵母细胞的细胞核膨大，染色质高度疏松，外包完整的核膜，此时的细胞核又称为生发泡[10,11]。不同物种的哺乳动物卵母细胞停滞在双线期的时间也不相同，几个月甚至几年。大部分初级卵母细胞在减数分裂前就已经发生凋亡、退化[12]。在哺乳动物达到初情期后，随着卵泡的发育和促性腺激素的作用下，卵母细胞逐渐恢复减数分裂的能力，从而进入成熟分裂周期进而完成第一次减数次分裂，分裂成两个大小不同的细胞，大的细胞为次级卵母细胞，较小的细胞为第一极体。只有卵母细胞受到体内的微量高效的化学物质刺激后才会发生生发泡破裂（Germinal vesicle breakdown, GVBD），生发泡破裂是卵母细胞减数分裂抑制恢复的标志，此时的卵母细胞染色质高度凝集，核仁消失，核膜发生破裂。随后次级卵母细胞开始进行第二次减数分裂并停留在中期，此时的次级卵母细胞具有受精的能力，一旦精子与卵母细胞在输卵管结合成为合子，次级卵母细胞继续并完成第二次减数分裂，并排出第二极体[13]。第一极体和第二极体最终都将发生退化。卵母细胞减数分裂时，染色体复制一次，细胞连续分裂两次。在卵母细胞减数分裂前的间期，DNA和染色体进行复制，但染色体数目不变，因此卵原细胞和初级卵母细胞的染色体数目都为2n。减数第一次分裂可分为四个时期：前期、中期、后期和末期，其中前期又可分为细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期。在减数第一次分裂的末期，一个初级卵母细胞分裂成一个次级卵母细胞和第一极体，染色体数目减半，次级卵母细胞的染色体数量为n。紧接着开始减数第二次分裂，在分裂后期，着丝点分裂，两条姐妹染色单体分开，此时细胞的染色体数目为2n。减数第二次分裂结束后，形成染色体数目为n的单倍体卵子[14]。在受精的过程中，精子与卵子结合形成染色体数目为2n的合子，这样染色体的数目又与体细胞相同。减数分裂是遗传的基础，是保证进行有性生殖的物种染色体数目稳定的重要机制，保证了遗传物质的相对稳定，同时为物种在有性生殖过程中的变异提供了物质基础[15]。
没有成熟的卵子在体外适宜的培养条件下同样可以发育成具有功能的成熟卵子，此过程称为卵母细胞体外成熟。卵母细胞体外成熟（in vitro maturation, IVM）技术是辅助生殖技术的重要组成部分，提高了卵母细胞的利用率[16]。此技术多用于体外受精（in vitro fertilization, IVF），对治疗不孕不育，防止因超数排卵导致的卵巢过度刺激综合征具有重要意义，还可将未成熟的卵母细胞取出后冷冻，为相关领域的研究提供宝贵的资源。早在1989年已有实验采用体外成熟技术、体外受精技术获得体外受精猪[17]。2000年，通过卵母细胞体外成熟技术诞生了国际上的首例克隆猪[18]。在某些方面上，猪与人类有许多相像的地方，可以作为理想的研究模型，卵母细胞体外成熟技术在胚胎移植和克隆方面具有重要意义，可以减低促性腺激素对卵巢的刺激，由此降低卵巢疾病的发生率[19,20,21]。但是，未成熟卵母细胞体外成熟技术还存在一些缺陷，目前卵母细胞体外成熟实验中主要采集的是有腔卵泡中的卵丘卵母细胞复合体（cumulusoocyte complexes, COCs），但大部分卵泡在其发育过程中发生闭锁，然后退化，导致卵丘卵母细胞复合体数目较少，不能充分进行实验研究，导致卵母细胞体外成熟率低，体外受精率低，优质胚胎数量较少等问题还未解决，阻碍了人工辅助生殖技术的发展。在采集卵丘卵母细胞复合体的过程中发现卵巢中还有许多未形成透明带的卵母细胞，由于这些细胞体积小于卵丘卵母细胞复合体，但又比颗粒细胞体积大，数量较多，但收集较为困难，因此并未受到过多的关注。对于这些未完全发育成熟卵母细胞的研究有助于相关胚胎技术的发展。目前有关动物腔前卵泡的研究已取得了一些进展：冷冻保存的小鼠原始卵泡在适宜的条件下经体外培养、受精和胚胎移植后可以得到后代小鼠[22]；绵羊、山羊、奶牛和牛的腔前卵泡在无血清培养系统中进行了长期的体外培养后可以形成形成卵泡腔，但能否进行体外成熟，体外受精还需进一步的研究[23]；猪腔前卵泡经体外培养成熟后能受精并发育成囊胚[24]，这标志着腔前卵泡中的卵母细胞具有发育的潜力。但腔前卵泡中的卵母细胞成熟率低且未形成透明带的卵母细胞分离技术还不完善，相关的体外成熟培养实验尚未开展，需要进一步研究其发育机制和体外培养的适宜条件[25]。因此本实验拟建立未形成透明带前卵母细胞的分离方法，并对分离出来的卵母细胞进行状态的检测，包括其在卵巢内的数量分布及细胞核的状态观察。依据现有的研究成果，再深入研究卵母细胞的发育，结合卵丘卵母细胞复合体体外成熟培养的实验条件，综合考虑未形成透明带的卵母细胞与具有透明带的卵母细胞的不同之处，综上所述，这一实验可以弥补卵母细胞及胚胎发育领域对未成熟形成透明带的卵母细胞研究的不足，解决卵丘卵母细胞复合体数量较少这一难题，进而能够更加深入研究与其相关的生物技术研究。

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