AMPK作为真核细胞中高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是调节能量稳态和代谢应激的主要传感器，参与到机体内多种生理生化过程。本试验旨在探究日粮限制条件下公羊睾丸中AMPK表达量的变化，从而揭示能量对公羊睾丸发育的影响。首先选取首先选取8只体况相似（22.02±0.14 kg）、健康的3月龄雄性湖羊随机分成二组C组（100%能量，对照组，n=4）和15% ER（15%能量限饲，n=4），限饲60 d后，每组屠宰后，进行称重、采集睾丸组织。通过免疫组化法、qRT-PCR和Western-blot等方法，进行AMPK定位、及AMPK相关基因和蛋白表达水平的研究。结果表明p-AMPK（Thr172）主要定位在生精细胞的细胞核中；同时与对照组相比，能量限制组ULK1、AMPK 、mRNA表达水平显著增加（P<0.05），AMPK、p-AMPK和ULK1蛋白表达升高（P<0.05)。综上所述，能量限制会上调AMPK 在睾丸内的表达，从而激活AMPK信号通路，来抑制公羊睾丸组织的发育。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法5
1.1试验设计5
1.2主要仪器 5
1.3主要试剂 5
1.4主要溶剂制配 5
1.4.1免疫组化抗体稀释 5
1.4.2 4%多聚甲醛固定液 5
1.5试剂方法 5
1.5.1样品处理 5
1.5.2免疫组织化学（IHC） 6
1.5.3睾丸组织总RNA提取和反转录6
1.5.4荧光定量PCR 6
1.5.5 蛋白质提取及变性 6
1.5.6 Western Blot 7
1.6统计分析 7
2结果与分析 7
2.1公羊睾丸组织中pAMPK(Thr172)蛋白的表达定位7
2.2能量限制对公羊睾丸中AMPK相关基因mRNA表达的影响 8
2.3能量限制对公羊睾丸中AMPKULK1通路上下游蛋白表达的影响 8
3讨论 9
致谢10< *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072^ 
br /> 参考文献11
日粮能量限制对公羊睾丸中AMPK表达的影响
引言
引言：睾丸发育和精子发生的正常进行是保证优良种公畜繁殖能力和保障优良种群的代代延续至关重要的环节，但公畜生殖力下降甚至不育的状况在当前畜牧业中十分普遍[1]。在睾丸中精子的正常发生是一个非常复杂和协调的过程，正常的精子发生需要公畜日常进食的营养平衡、精密的激素分泌和调控且提供公畜正常稳定的睾丸微环境等，其中任一环节产生异常都可能会导致精子无法正常发生且可能会对雄性生殖道造成许多疾病，如睾丸炎、无精症、精索静脉曲张、少精症、弱精症和隐睾症[2]。上述提到，影响公羊繁殖性能的因素有很多，其中日粮能量水平是其中的重要因素。能量不仅是评定饲料营养价值的重要指标，也影响着动物机体正常生长发育，维持基本的生命过程。在实际生产中，能量的过高过低都会影响公羊的繁殖性能。能量过高会造成营养浪费，还可能会导致公羊脂肪沉积，影响公羊性欲。过低则不能满足营养需要，会阻碍公羊睾丸和性腺的发育，性机能衰退。适当的日粮能量水平不仅可以提高公羊的精液品质，还可以获得更多的优质后代，对培养优质种质资源，加速育种进程具有重要意义。
雄性哺乳动物精子发生的前提是睾丸正常结构和功能的形成。哺乳动物睾丸呈略扁的卵圆形状，表面被白膜的厚纤维结缔组织囊所覆盖，沿着睾丸表面逐渐变薄向后延伸形成睾丸纵膈，并将睾丸的实质部分分为一系列睾丸小叶，睾丸小叶中包含许多条曲细精管，曲细精管的壁内主要包括生精细胞、支持细胞（Sertoli cells，SCs）和管周肌样细胞（Peritublar cell，PCs）。“血睾屏障”就是支持细胞在曲细精管壁的基底部形成的细胞间紧密连接，阻止了循环物质进入曲细精管中产生的特有的细胞发育环境。在睾丸小叶内，曲细精管形成环，其末端延伸为直管状延伸，称为精直小管，其进入睾丸的纵隔并且互相交织成睾丸网，在睾丸后缘的上部汇集成612条输出管连接形成附睾管。这条管在体内长约56米，被广泛卷绕并形成附睾的结构，可分为附睾的头部，体部和尾部。在其远端极点，附睾的尾部产生输精管[3]。精子发生的场所就是在上述所提的曲细精管内，那么如何决定雄性繁殖力的最重要的指标就是精子能否在曲细精管内顺利发生，这涉及到精子发生过程，精原干细胞经过有丝分裂分化为精母细胞，随后精母细胞减数分裂从四倍体初级精母细胞分裂成单倍体的精子细胞。随后精子通过曲细精管进入输出管，在附睾中最终成熟[4]。精子发生是个复杂且漫长的过程，需要多级激素调控，如需要下丘脑分泌GnRH刺激垂体产生的FSH和LH、受LH刺激在睾丸中产生的睾酮，睾酮和FSH作用于SCs内的受体，以刺激SCs产生精子发生所需的各种条件[3]。精子发生依赖于LCs在LH调控下产生睾酮的能力，SCs的数量决定了睾丸的最终生精数量。当雄性动物第一次产生具有受精能力的精子，并表现出完整性行为时即达到了初情期，这个时期虽然有性行为和成熟的精子，但繁殖力低不能配种。经过初情期后，青年公畜生殖器官、性机能发育成熟，并具有授精能力此时机体达到性成熟。当机体生长结束，具备成年动物所固有的形态和结构时达到体成熟。了解雄性哺乳动物性机能发育时期，可以更好针对各个时期进行研究，完善各个时期的发育机制。
AMPK作为机体的能量传感器，对能量的变化及其敏感。AMPK即单磷酸腺苷活化蛋白激酶，是一种真核生物体内调节细胞代谢的高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，以 α，β和 γ三种亚基组成的异源三聚体的形式广泛存在于细胞中[5]。AMPK几乎存在全身大部分细胞中，通过感知细胞能量代谢状态的变化，维持机体的能量代谢平衡。保持能量稳态和在低营养期间执行适应性反应，是所有细胞的关键功能。目前AMPK在睾丸上的研究也逐渐深入，已有研究表明，AMPK参与睾丸内精子的运动。在转基因小鼠中敲除AMPK催化亚基α1基因，发现小鼠的精子活动率和曲线速度都显著降低[6]。同时，AMPK抑制剂化合物C处理会显著降低公猪活动精子的百分比，精子曲线速度等[7]。同时AMPK还会调节精子的顶体反应，有助于维持顶体膜的完整性。AMPK还可以通过影响SCs增殖参与精子质量的调节，还可通过参与调控精子运动和顶体反应直接影响精子的质量。运用基因敲除技术在敲除LKB1、TSC1和TSC2后可导致小鼠睾丸精子细胞减少、破坏SCs 极性和睾丸细胞紧密连接功能和组织完整性，同时LKB1基因敲除抑制小鼠睾丸组织中AMPK信号表达，亦可激活mTOR信号[8]。有研究证实 AMPK 磷酸化蛋白高表达可以抑制其下游的mTOR信号，进而影响公猪睾丸中SCs 数量和精子生成量[9]。此外，AMPK可通过参与调节抗氧化酶的活性，缓解脂质过氧化从而影响精子生成。目前，AMPK机制在睾丸上的研究仍处于探索阶段，但AMPK在睾丸发育和精子发生过程中发挥重要作用，进一步探究AMPK在雄性生殖功能中的作用，研究AMPK通路在睾丸发育和精子发生过程的作用机制，可为治疗雄性不育症、改善精液品质和精液冷冻提供新的思路。

原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/dwyx/605113.html