双酚A（Bisphenol A，BPA）是一种在环境中广泛存在的化学物质，进入机体内会对各种组织器官系统造成不同程度损伤。目前，关于BPA 的大部分研究都集中在其生殖毒性上，近来有研究发现BPA能够促进鸡胚卵母细胞减数分裂，在生殖方面发挥着积极作用。本实验通过对处于不同孵化时期的种鸡蛋进行浓度为0.05mg/胚的BPA注射，在指定日期采集鸡胚卵巢组织进行HE染色、免疫荧光检测和PCR检测以及数据分析。结果显示在相同孵化时期BPA处理组的卵巢皮质厚度大于对照组。在减数分裂时期，与对照组相比，处理组中γH2AX标记的荧光蛋白强度显著增强。此外,甲基化相关基因Dnmt1和3b在鸡胚卵母细胞减数分裂阶段表达水平呈下降趋势，Dnmt3a表达上调，TET(1、2、3)家族中，TET1在减数分裂时期表达水平出现显著变化，TET2和3表达下调。BPA处理后，胚龄为15.5天时，Dnmt3a的表达水平显著下降，孵化到18.5天时，Dnmt1在处理组的表达水平增强。总之，BPA可以在鸡胚卵母细胞减数分裂进程中产生积极的影响。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 4
Key words 4
引言 5
1 材料与方法 6
1.1 材料 6
1.1.1实验动物及样品采集 6
1.1.2主要试剂以及仪器 6
1.2实验方法 7
1.2.1卵巢组织切片制作与HE染色 7
1.2.2免疫荧光染色 7
1.2.3鸡胚卵巢总RNA提取与逆转录聚合酶链式反应合成CDNA 8
1.2.4数据分析 9
2 结果 10
2.1 BPA暴露下HE染色鸡胚卵巢组织 10
2.2 BPA对γH2AX在不同日龄鸡胚卵巢组织中的表达水平的影响 10
2.3 BPA对鸡胚卵巢组织甲基化基因表达的影响 12
3 讨论 12
致谢 14
参考文献 14
双酚A对鸡胚卵母细胞减数分裂进程的影响
引言
引言
双酚A（Bisphenol A，BPA）为2二（4羟基苯基 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072^ 
）丙烷，是一类生活中广泛存在的有机化合物，可以使用BPA来生产塑料制品。含有BPA的材料被大量用于人类生产生活，如食品与饮料、白酒包装[1]。BPA的制品的使用频繁，据预测其使用量至2020年可达到960万吨[2]。然而，大量研究显示BPA是具有毒性的，含有BPA的塑料制品在经过反复使用或者处在酸、碱和高温环境中，能够游离出来污染环境，其被人或动物体摄入后能够干扰体内激素合成、分泌和作用，进而直接或间接对机体造成损伤[3]。近年来，塑料制品的使用量随着生产与生活水平的提高有较大幅度的增加。BPA普遍存在于自然环境内，调查显示BPA在空气、土壤，水和食品等都被检测出[4]。因此，BPA与人类和动物体的关系密不可分。
作为一种广泛分布在外界环境的内分泌干扰物，BPA具有与雌激素的类似的化学结构以及作用[5]。研究表明BPA可以与甲状腺激素激素受体、雌激素受体、雄激素受体相互结合[6]，从而进入机体干扰分泌系统[7]，并且BPA与其代谢产物能够对机体的中枢神经系统、免疫系统、内分泌系统、生殖系统等造成影响。其中，BPA在生殖方面的研究较为广泛。
在雌性生殖方面，孕期暴露于BPA会对子代情绪症状、学习与记忆能力等行为和认知发育造成不良影响[1]。以小鼠为模型的研究显示高浓度的BPA对胎鼠卵巢发育具有毒害作用[8]。大量研究表明BPA对雌性生殖器官的发育、形态和功能造成影响，同时干扰雌二醇、卵泡刺激素等生殖激素的生成[910]。高剂量灌胃对小鼠进行染毒处理实验结果表明BPA能提高卵巢细胞内活性氧水平，促进卵巢细胞凋亡,造成卵巢及子宫损伤[11]。魏媛媛等研究表明妊娠期母鼠暴露BPA会紊乱仔代生殖激素分泌，这可能是因为其提高了仔鼠DNA甲基化酶的转录活性[12]。有研究表明双酚A可能通过PPARγ核受体途径干扰雌二醇激素的生成[13]。
在雄性生殖方面，雄鼠腹腔注射BPA会减少精子数量，降低活动精子百分率[14]。经BPA灌胃染毒后的雄鼠其后代产仔率下降[15]。对睾丸支持细胞进行BPA染毒会造成支持细胞骨架损伤，改变其形态，进而造成生殖系统损伤[16]。此外，有研究表明一定剂量的BPA作用会引起睾丸支持细胞和精子细胞凋亡[17]，并会显著降低与睾酮合成相关的蛋白水平[18]。有研究发现BPA暴露影响精子发生的机制之一可能是其使雌激素受体启动子区甲基化异常[19]。此外，组蛋白甲基化水平改变也是BPA影响小鼠生精功能的作用机制之一[20]。
目前，大部分与BPA相关的生物研究都集中在其对雄性生殖系统和妊娠期雌鼠的卵巢及子宫损伤方面。然而，近来有研究表明低浓度的BPA可以促进卵母细胞的减数分裂，并且提高相关基因的表达[7]。BPA处理后能够与雌激素受体结合，表现出DNA甲基化被抑制[21]。此外也有研究表明低剂量的BPA处理对原始卵泡的发育有一定的促进作用[22]。在使用低剂量的BPA处理小鼠后，Hoxa10转录因子表达增强，介导子宫内膜样基质组织增生[23]。由此可见，机体暴露BPA在生殖方面的影响可能呈剂量依赖性，并且在使用低剂量的BPA处理后，其对生殖系统方面的影响可能会起到积极的作用。因此，在本试验中，我们将采用鸡胚模型，利用IOF技术、HE染色、免疫荧光染色和RTPCR方法，针对“BPA对鸡胚卵母细胞减数分裂进程的影响”这个科学问题，探究BPA对鸡胚卵巢卵母细胞减数分裂的影响，深入了解BPA在卵巢发育方面的作用，为预防BPA的毒害、探索BPA的有利作用以及减少胚胎发育的异常奠定理论基础。
材料与方法
材料
实验动物及样品采集
调整孵化箱孵化条件，即设定孵化温度为38℃左右，相对湿度设定为60%左右，法国萨索种鸡蛋孵化到指定孵化日龄。部分处理组鸡胚在孵化到E10.5，E12.5， E15.5时钝头蛋清注射0.05mg/胚的BPA，继续孵化到 E12.5，E15.5和 E18.5时采集各组的左侧卵巢用于HE染色和免疫荧光染色，对照组鸡胚注射PBS。部分处理组在E0天孵化开始钝头蛋清注射0.05mg/胚的BPA，此后每隔3天注射一次BPA,并同时采集左侧卵巢用于PCR检测。
将指定孵化日期的鸡胚利用镊子从钝头敲破，用镊子钳住鸡胚颈部，挑出鸡胚，放入 PBS 液体中，用剪刀剪开腹腔，找到性腺，用镊子取下左侧性腺，置于装有4%多聚甲醛的管中，做好相应标记后于4°C保存。
主要试剂以及仪器
主要试剂
所用试剂
来源
BPA
Trizol溶液
反转录试剂盒
γH2Ax

原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/dwyx/605094.html