随着体外培养技术和菌种鉴定技术的不断成熟，甲烷菌的分类拓展到了第七个目Methanomassiliicoccales（Mmc），Mmc甲烷菌在反刍动物消化道中具有重要作用，但由于分离纯化困难，Mmc的系统进化分类体系至今未完善。Mmc甲烷菌严格利用氢气还原甲基化合物生成甲烷，因此本实验利用三甲胺为底物富集Mmc甲烷菌，在此基础上结合高倍梯度稀释和抗生素筛选对Mmc富集培养液进行分离纯化，最终成功得到一株Mmc甲烷菌菌株，并验证其营养类型，可为Mmc甲烷菌的进一步研究提供实验材料。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1实验仪器和试剂2
1.2实验材料和方法2
1.2.1接种物2
1.2.2培养基成分2
1.2.3培养基的制备3
1.2.4 DNA提取3
1.3三甲胺富集培养3
1.3.1 Mmc甲烷菌的接种与富集3
1.3.2总产气量、氢气和甲烷的测定4
1.4分离纯化4
1.4.1高倍梯度稀释4
1.4.2抗生素筛选4
1.4.3梯度稀释后培养液的Mmc甲烷菌检测4
1.4.4纯化后培养液的细菌检测4
1.4.5纯化后培养液的甲烷菌检测4
1.5营养类型鉴定 4
2 结果与分析5
2.1富集过程中氢气、甲烷的变化5
2.2分离纯化5
2.2.1 PCR检测梯度稀释后培养液的Mmc甲烷菌5
2.2.2纯化后培养液的细菌检测6
2.2.3纯化后培养液的甲烷菌检测6
2.2.4甲烷菌序列分析7
2.3营养类型鉴定8
3 讨论9
致谢9
参考文献9
三甲胺利用甲烷菌的分离培养
引言
甲烷菌是唯一以甲烷为代谢终产物的严格厌氧微生物[1]。反刍动物消化道中的甲烷菌可将二氧化碳、氢气、甲酸等物质转化成甲烷，由此产 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ￥351916072￥ 
生的甲烷将加剧温室效应，还会导致饲料中能量的损失，降低养殖效率[2]。因此深入了解反刍动物甲烷菌，对实行甲烷减排、缓解温室效应具有经济和环境双重效益。近年来随着研究的不断拓展、体外培养技术和测序技术的逐渐成熟，甲烷菌的系统分类也在不断完善中，由6个目扩展到7个目，分别为甲烷火菌目( Methanopyrales )、甲烷球菌目( Methanococcales )、甲烷杆菌目( Methanobacteriales )、甲烷微菌目( Methanomicrobiales ) 、甲烷八叠球菌目( Methanosarcinales )和甲烷胞菌目( Methanocellales )以及新建立的第七个目 “Methanomassiliicoccales”（简称Mmc）[3]。
最新研究表明，Mmc 甲烷菌是反刍动物瘤胃中仅次于甲烷杆菌目的第二大甲烷菌菌群[45]，在一些条件下，甚至可以成为最优势菌群[6]，在反刍动物消化道微生物系统中扮演着重要角色，对反刍动物甲烷生成也具有重要影响。但由于营养需求复杂、生长缓慢、分离困难，目前已分离培养的Mmc菌株很少，所以难以对Mmc甲烷菌进行完整的系统分类。目前Seederf [6]等对已发表的Mmc 16S rRNA基因序列进行系统进化分析，并将这些序列在属水平（9597%相似性）进行归类，共形成 12个组（临时命名为Group1 Group12）。甲烷菌主要存在4种营养类型[78]：（1）氢营养型：主要利用H2、甲酸还原CO2生成甲烷；（2）乙酸营养型：裂解乙酸生成甲烷和CO2；（3）甲基营养型：利用甲醇、甲胺、二甲胺、三甲胺等甲基化合物生成甲烷；（4）甲基还原营养型：利用氢气或甲酸作为电子供体还原C1甲基化合物生成甲烷。Mmc甲烷菌属于甲基还原营养型，利用氢气还原C1甲基底物生成甲烷[911]。在甲烷生成过程中，Mmc严格依赖其独特的辅酶M甲基转移酶系统(Mt)，每种Mt由一个具有底物特异性的甲基转移酶MT1、甲基转移酶MT2以及一个具有底物特异性的类咕琳蛋白共同组成[12]。本实验的底物三甲胺可诱导甲基转移酶MT1 mttB基因及类咕琳蛋白mttC基因的表达，同时还可作为甲基转移酶MT2 mtbA基因的底物。甲基转移酶MT1具备催化三甲胺的甲基基团转移至还原态类咕琳蛋白的功能，再利用甲基转移酶MT2将类咕琳蛋白上的甲基基团转移到辅酶M( 2mercaptoethanesulfonic acid，HSCo M)的巯基上从而生成CH3SCo M，最后辅酶B（HSCo B）在甲基辅酶M还原酶的催化下还原CH3SCo M生成甲烷和异质二硫化物（Co BSSCo M）[1213]。因此Mmc甲烷菌可利用1 mol的氢气还原三甲胺生成1 mol的甲烷，即3H2+C3H10N+→3CH4+NH4+。
纯Mmc菌株的缺少直接限制了对Mmc甲烷菌的深入研究，因此分离纯化反刍动物消化道中的Mmc甲烷菌菌株，对于完善其系统进化分类体系、分析其在反刍动物消化道中的作用十分必要[14]。Mmc甲烷菌缺少将CO2还原为甲基辅酶M的完整代谢途径，导致其严格以氢气为电子供体，还原甲基化合物生成甲烷[13]，因此在提供适量甲基底物的条件下，Mmc甲烷菌能在与其他甲烷菌的竞争中快速繁殖，有助于高效富集Mmc菌株。本实验室之前研究表明，以三甲胺作为唯一供应碳源时，Mmc甲烷菌可利用氢气生成甲烷。本实验以奶牛消化道内容物为接种物，利用底物三甲胺富集培养的方式，结合高倍梯度稀释和抗生素筛选的方法分离纯化获得一株Mmc甲烷菌，并验证其营养类型，最后于适宜条件下保存这一菌株，可为后续揭示该目甲烷菌在反刍动物甲烷生成过程的作用研究提供实验材料及理论基础。

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