目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words4
引言4
1 材料与方法5
1.1 材料5
1.2 小鼠颗粒细胞的原代培养5
1.3 Western Blot分析6
1.4 实时荧光定量PCR（qRTPCR）7
2 结果与分析8
2.1 SFN促进小鼠卵巢颗粒细胞的增殖活性8
2.2 SFN促进雌激素的产生8
2.3 SFN在表观遗传修饰上的作用9
3 讨论 10
致谢11
参考文献12
图1 SFN促进小鼠颗粒细胞中PCNA及Cleavedcaspase3的表达8
图2 qRTPCR和Western blot检测SFN对StAR等类固醇激素合成酶表达的影响9
图3 qRTPCR和Western blot检测SFN对AcetylH3和DNMTs表达的影响10
SFN对小鼠卵泡颗粒细胞增殖、功能以及组蛋白乙酰化修饰的影响
摘 要
[目的]萝卜硫素（sulforaphane，SFN）是十字花科植物富含的一种异硫氰酸酯类化合物，本文试图探索SFN对卵泡颗粒细胞增殖与功能的影响，为利用SFN改善母畜繁殖性能奠定基础。[方法]体外培养小鼠卵泡颗粒细胞，在培养液中添加SFN，检测颗粒细胞增殖活性、雌二醇合成水平以及组蛋白乙酰化修饰等指标的变化。[结果]低浓度的SFN促进卵泡颗粒细胞增殖：CCK8活性上升，细胞增殖标记蛋白PCNA表达增加，细胞凋亡标记蛋白Caspase3显著下调；与此同时，低浓度的SFN促进了颗粒细胞雌二醇的合成，类固醇合成酶StAR、CYP19A1、CYP17A1的蛋白表达水平显著上调。最后研究还发现，低浓度的SFN处理颗粒细胞组蛋白H3的乙酰化修饰显著升高，但DNA甲基转移酶Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b的转录活性无显著变化。[结论]低浓度的SFN能够促进小鼠卵泡颗粒细胞增殖与雌二醇合成，并且这种促进作用可能与SFN上调细胞组蛋白乙酰化修饰有关。
引言
萝卜硫素 (Sulf *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: *351916072* 
oraphane)是从十字花科蔬菜如西兰花中分离出来的植物活性物质，萝卜硫素最早被发现能够对各种癌细胞产生生长抑制，随着对萝卜硫素的研究不断深入，发现萝卜硫素具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎症以及调控表观遗传修饰等功能[13]，如Hussain等研究发现SFN可以有效抑制 MCF7乳腺癌细胞的增殖[4]，抑制几种黑素瘤细胞系的增殖[5]，还可以阻断大鼠由苯并蒽诱导的乳腺肿瘤的形成，乳腺肿瘤的发生率、多样性和大小均显著减少，且肿瘤发生被推迟[6]Ferreira等研究还发现SFN还能够诱导MG63骨肉瘤和乳腺癌细胞等癌细胞系的凋亡[7，8]，并抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移和侵袭[9]，因此，含SFN的植物化合物也被考虑用于治疗恶性血液病[10，11]。此外，还有研究表明萝卜硫素能够调控Toll样受体4（Tlr4）和微管蛋白的活性来发挥抗炎作用[12，13]，在此基础上，Greaney等人也发现萝卜硫素可以抑制AIM2等炎性小体的活性[14]。
萝卜硫素作用的表观遗传机制受到越来越多的关注。有研究认为，SFN对细胞增殖与凋亡的调控作用可能与其抗氧化与调节表观遗传修饰的特性有关。SFN具有很强的抗氧化活性，能够促进抗氧化关键蛋白Nrf2的表达与激活，进而激活Nrf2下游抗氧化基因HO1、NQO1和UGT1A1的表达 [15,16]。此外，萝卜硫素还是一种天然的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDIs)，它可以通过与组蛋白去乙酰化酶（HDAC）活性位点的氨基酸残基相结合来抑制其活性，有研究发现SFN处理肿瘤细胞组蛋白乙酰化修饰水平提高50100%。此外，研究还发现SFN能够下调细胞DNA甲基转移酶（DNMTs）的表达与活性。
颗粒细胞是卵巢发挥生殖功能的重要细胞。随着卵泡发育颗粒细胞会从单层继续增殖到多层，慢慢地形成卵丘将卵母细胞包围住。同时，卵巢颗粒细胞也是体内性激素的主要来源。成熟卵泡的颗粒细胞是构成卵泡的最大的细胞群 [17]。颗粒细胞是卵巢的功能细胞，颗粒细胞的增殖分化对卵母细胞的发育和卵巢的生殖功能起着决定性的作用[18]。细胞增殖核抗原（PCNA）是反映细胞增殖状态的一个指标，它存在于体内繁殖旺盛的细胞中，是DNA聚合物酶δ的辅助蛋白，可参与NDA合成，是细胞生长和繁殖的标记物。E. Tousson等的研究表明，PCNA是聚合酶的加工因子，是DNA复制机制的关键组成部分[19]。PCNA基因的表达与细胞增殖密切相关[20]，因此PCNA蛋白的表达也可以作为判断颗粒细胞增殖活性的标志。
类固醇激素合成酶能够对睾酮、孕酮和雌二醇等的合成起到催化作用[21]。类固醇合成酶主要包括细胞色素P450成员，胆固醇在P450胆固醇侧链裂解酶和3β羟类固醇脱氢酶的作用下转化为孕酮，在17α2羟化酶和C17，10碳链裂解酶的作用下孕酮转化为雄激素。雄激素进入到颗粒细胞，然后在P450芳香化酶的催化作用下转化为雌激素。
先前有研究表明，卵泡的发育受到多方面因素的影响，而下丘脑垂体性腺轴的激素内分泌是其中相对比较重要的一种调节机制。下丘脑能够分泌的促性腺激素释放激素，作用于垂体来调节垂体中FSH和LH的合成和分泌。垂体分泌的FSH能够诱导CYP11A1、3βHSD、CYP17A1、CYP19A1等卵巢卵泡中类固醇激素合成酶基因的表达来进一步影响类固醇激素的合成和分泌。有研究表明，类固醇合成的起始底物是胆固醇，胆固醇进入细胞以后在类固醇生成急性调节蛋白（StAR）的作用下转运到线粒体中，然后经过线粒体内CYP11A1的催化而被分解为孕烯醇酮和异己醛。胆固醇裂解为孕烯醇酮之后，3βHSD便催化孕烯醇酮生成孕酮，卵泡颗粒细胞中3βHSD的表达量于卵泡颗粒细胞的发育状态有关[22]。此外，卵巢中CYP19A1特异性分布于颗粒细胞，以雄激素为底物催化合成雌激素，雌激素可通过促进卵泡发育，促性腺激素受体的颗粒细胞表达，类固醇生成和颗粒细胞形成的间隙连接形成以及抑制颗粒细胞凋亡来促进卵泡发育，并最终排卵[23]。Richards等的研究表明，卵泡的发育和颗粒细胞的增殖分化取决于激素特异性受体的类固醇蛋白激素调节[24]。雌激素尤其是雌二醇参与调节卵泡的生长发育。雌二醇可以通过刺激颗粒细胞的增殖以及阻止颗粒细胞的凋亡，从而促进卵泡的正常生长发育。相反，颗粒细胞和卵泡生长发育在雌二醇分泌不足的卵泡中会受到抑制。有研究表明卵泡颗粒细胞中的雌激素与雄激素作用类似，能够与雌激素受体结合而增加促性腺激素的作用效果。

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