目录
摘要1
关键词1
ABSTRACT1
KEY WORDS1
引言2
1 材料与方法3
材料3
1.1.1 抗体与试剂...3
1.1.2 主要仪器设备...4
1.1.3 抗体和试剂的制备...4
1.2 方法 5
1.2.1 卵母细胞的采集和培养5
1.2.2 显微注射Rab7 siRNA5
1.2.3 免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察6
1.2.4 数据分析6
2 结果与分析6
2.1 卵母细胞减数分裂中RAB7的表达与定位6
2.2 RAB7参与卵母细胞减数分裂成熟的调控7
2.3 RAB7调节卵母细胞减数分裂中的肌动蛋白动力学8
2.4 RAB7影响卵母细胞减数分裂中的纺锤体迁移10
3 讨论.11
致谢12
参考文献13
图21 卵母细胞减数分裂中RAB7的表达与定位7
图22 RAB7参与卵母细胞减数分裂成熟的调控8
图23 RAB7调节卵母细胞减数分裂中的肌动蛋白动力学9
图24 RAB7影响卵母细胞减数分裂中的纺锤体迁移10
表11 封闭液的配制5
表12 透膜液的配制5
表13 洗涤缓冲液的配制5
RAB7在卵母细胞减数分裂中的作用
摘要
RAB7是小分子GTPase中RAB家族的成员之一。囊泡运输RAB家族是调控细胞骨架动力学的一类重要调控因子，RAB7作为囊泡运输因子，主要定位于晚期内体，并调节向晚期内吞室的转运，进而从早期内体转运至晚期内体，以及从晚期内体转运至溶酶体。RAB7蛋白可以调控凋亡、神经营养蛋白的转运与信号转导、神经突生长、吞噬作用、自噬和线粒体吞噬等生理过程。但RAB7在卵母细胞减数分裂中的调控作用尚不清楚，本实验拟探究RAB7在卵母细胞减数分裂中的表达与调控机制。结果表明，RAB7在卵母细胞成熟过程中集中分布于纺锤体外周与皮质区域，其定位模式和肌动 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072* 
蛋白丝相类似。敲低RAB7会引起卵母细胞胞质分裂异常，如极体排出失败或排出大极体，并且导致纺锤体迁移失败，这可能是由于敲低RAB7后肌动蛋白动力学降低所引起的，肌动蛋白丝的荧光强度也证明了这一点。综上所述，RAB7对于卵母细胞的成熟过程十分重要，并且RAB7对于卵母细胞减数分裂中依赖于肌动蛋白动力学的纺锤体迁移也是必需的。
引言
卵母细胞的成熟质量对于受精以及早期胚胎发育两个过程具有重要意义。在有丝分裂阶段，细胞对称分裂；减数分裂阶段，哺乳动物卵母细胞会经过连续的两次不对称细胞分裂后，从而产生了功能性的单倍体卵母细胞和两个不参与DNA复制的小的极体，单倍体卵母细胞经受精后发育形成胚胎，而小极体则迅速退化。这种不对称的划分使得大多数的母体成分可以保留在卵母细胞中[1]。在生发泡期（GV）停滞的成年卵母细胞在到达生发泡破裂（GVBD）后再次进行减数分裂过程，在减数第一次分裂中期（MI），哺乳动物卵母细胞的纺锤体位于细胞胞质中心位置，当染色体的着丝点对称地排列在赤道板上，纺锤体会沿着自身长轴迁移至最接近的皮层区域[2,3]。此时，肌动蛋白积聚在被纺锤体的肌球蛋白II环覆盖物包围的皮质区域中。第一极体排出后，卵母细胞迅速进入减数第二次分裂中期（MII），卵母细胞皮层下方第一个分裂位点旁的纺锤体组件，在纺锤体上方也形成了皮质肌球蛋白II环，这与减数第一次分裂中期的情况相似[4]。因此，这种不对称的细胞分裂与卵母细胞减数分裂过程中的纺锤体的位置与皮质极化高度相关，而纺锤体的迁移依赖于肌动蛋白动力学，总体而言，肌动蛋白动力学对于哺乳动物卵母细胞减数分裂的成熟有重要意义。
小GTPase超家族存在真核生物中，其在细胞分化，细胞分裂，囊泡运输，核装配以及细胞骨架动力学等几个方面起着关键性作用。这个超家族包含以下五大类成员：Rab、Ras、Rho、Ran和Sar1/Arf。较小的GTPases可以通过处于活跃状态的GTP结合态和处于非活跃状态的GDP结合态互相循环转化从而起到调控作用[5,6]，许多研究也广泛报道了小GTPase超家族在哺乳动物卵母细胞独特的的不对称分裂过程中对于微丝骨架的重要作用。
近年来，诸多研究表明膜泡运输Rab家族是调控细胞骨架动力学的一类重要调控因子。Rab家族是小分子GTP结合蛋白Ras超家族中最大的一个分支，在人类中已经鉴定出了60多名RAB家族蛋白成员，在酵母中也发现了11名[7,8]。研究显示几种Rab GTPases在小泡的形成以及运输过程中起着至关重要的作用。RAB蛋白作为分子“开关”来调节运输小泡的形成，运输，束缚以及融合，这是调节细胞器之间运输的一般机制。也就是由特定RAB募集的蛋白质在其各自的膜运输途径的每个步骤中执行所需的各种功能[9]。并且Rab GTPases在与肌动蛋白或者是与微管过程相关的囊泡运输中也担任着重要角色[10]。微管和肌动蛋白丝是哺乳动物卵母细胞减数分裂的关键。已有研究证明，RAB3A可以调控胞质成熟及胞质分裂，并且影响皮质颗粒和外周纺锤体的迁移过程，导致卵母细胞的不对称分裂[11]。与RAB3有关的小泡或是其内容物也对细胞的不对称分裂有重要调控作用[12]。RAB11a阳性囊泡被认为是细胞骨架调节剂，在小鼠卵母细胞成熟过程中，RAB11a阳性囊泡可以调控纺锤体的不对称定位[13]。在小鼠卵母细胞分裂中期，有研究发现在RAB11囊泡胞外转运中，Spire肌动蛋白和肌球蛋白V (MyoV)马达协同调控成核功能。并且，与RAB11相近的其他Rab GTPases，比如RAB3、RAB8及RAB10，可以和肌球蛋白V马达相互作用[14]。RAB23可以调控Kif17的定位，通过结合乙酰化/去乙酰化有关酶，从而影响微管乙酰化水平[15]。与此同时，卵母细胞中的肌动蛋白微丝可以被Kif17结构域尾区以及肌动蛋白成核因子的整合调控。

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