目录
摘要 II
关键词 II
ABSTRACT III
KEY WORDS III
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 试验材料 2
1.1.1 湖羊DNA提取材料 2
1.1.2 湖羊RNA提取材料 2
1.1.3 克隆用质粒与菌株 2
1.1.4 引物 2
1.1.5 主要化学试剂和仪器 2
1.1.6 试剂及培养基配置 3
1.2 试验方法 3
1.2.1 湖羊miRNA27a序列克隆 3
1.2.2 miRNA27a在湖羊组织中的表达鉴定 5
1.2.3 数据分析 6
2 结果与分析 7
2.1 湖羊DNA提取结果 7
2.2 湖羊miRNA27a前体序列扩增及序列分析 7
2.3 miRNA27a在湖羊各组织中的表达鉴定 7
2.4 湖羊miRNA27a前体序列SNPs分型 8
2.5 miRNA27a SNP位点与湖羊产羔数关联性分析 9
3 讨论 11
3.1 miR27a 在组织中的表达及其调控作用 11
3.2 miR27a 基因多态性与湖羊产羔数的关联性分析 12
致谢 13
参考文献 14
miRNA27a克隆、SNPs筛选及其与湖羊产羔数关联性分析
摘 要
目的：为研究湖羊miRNA27a的组织表达及其SNP与产羔数的关联性。方法：以湖羊母羊为研究对象，克隆获得湖羊miRNA27a前体序列，利用实时荧光定量PCR检测其在湖羊各个组织中的表达水平；以湖羊母羊耳组织为实验材料，PCR扩增测序筛选湖羊miRNA27a基因的SNPs位点，应用SPSS16.0对不同基因型与湖羊各胎产羔数进行关联性分析。结果：RTPCR结果显示，miR27a在湖羊的11种组织中均有表达，在胃、肺、小肠中表达量较高，在卵巢、心、肌肉中表达量较低，在大肠、子宫、肝、脾、肾5种组织中的表达量介于之间；在192只湖羊中共检测到9个S *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: @351916072@ 
NP位点，其中13A/G位点共检测到三种基因型，其余各位点均只有两种基因型。检测到的9个位点PIC都在0.25到0.5之间，属于中度多态，其中只有9A/G位点和13A/G位点处于HardyWeinberg 平衡状态。关联性分析表明，24T/G突变位点的TT型湖羊二胎产羔数高于TG型（1.80±0.068 vs 1.66±0.085，P<0.05），而两种基因型的头胎（1.69±0.057 vs 1.67±0.058，P>0.05）和三胎产羔数(1.78±0.090 vs 1.76±0.119，P>0.05 )无显著差异；其余8个位点的不同基因型与湖羊各胎产羔数间差异均不显著。结论：miRNA27a可能参与调控湖羊的繁殖性能。
引言
MicroRNA (miRNAs) 是一类小的短链（20~25nt）非编码的内源表达的RNAs，通过直接与靶基因3’UTR的不完全结合，在转录水平后抑制靶基因信使RNA的翻译从而阻断靶基因的表达，并参与调控相应基因的生物学功能。miRNAs 有三种不同的形式：原始miRNA (primiRNA)、前体miRNA (premiRNA) 和成熟miRNA。PrimiRNA 来自3’UTR区的长转录物，被Drosha酶切割在细胞核形成premiRNA，然后细胞质酶Dicer将premiRNA 加工成为成熟的miRNA，成熟miRNA 5’端28个碱基被称为“种子序列”可以直接与靶基因3’UTR区结合调控靶基因表达[13]。
大量研究表明，miRNA 广泛参与了哺乳动物的激素分泌、发情、卵巢卵泡发育、精子形成和胚胎着床等生理过程的分子调控[4]。Ye等[5]研究发现miR3613p通过靶向FSHB负调节FSH合成和分泌。Romero等[6]通过小鼠模型研究DICER1在生殖细胞发育和精子发生过程中的作用，发现Dicer1在雄性生殖细胞发育早期的选择性消融导致不育，当条件性敲除Dicer1基因时，可以观察到圆形精子细胞数量减少，精母细胞凋亡数量增加，圆形精子到成熟精子的转变也受到严重影响。研究表明，miRNA功能通常在小鼠卵母细胞和早期植入前胚胎中受到抑制。在2细胞期之前miRNA活性被抑制，在2细胞期后抑制被缓解并且miRNA的表达被重新激活[7]。Alisch等[8]研究显示敲除miRNA合成过程中的酶Argonaute2会导致原肠胚死亡，表明miRNA在早期胚胎发育中的重要作用。
miR27a属于miR27家族成员之一[9]，通过调节细胞周期、细胞增殖、细胞分化、细胞调亡、血细胞生成等参与调控机体的生理和病理过程[10]。众多研究表明，miR27a 在疾病尤其在肿瘤中发挥重要作用，而在生殖领域报道较少。陶虎等[11]通过对山羊的miR27a 靶基因进行预测分析指出，miR27a 的靶基因参与了细胞增殖、转录调控、RNA 代谢、正调控信号传导等一系列重要的生命活动，预示 miR27a 在山羊繁殖过程中可能发挥着重要的作用。目前，已有研究表明miR27a参与卵巢内激素的合成与分泌、卵泡发育退化以及一些与卵巢相关的病理过程[12]。在小鼠中，卵母细胞周围颗粒细胞中miR27a表达水平MⅡ期较MⅠ期明显降低，miR27a表达上调，卵母细胞成熟率增多[13]。miR27a能通过抑制ZBTB10间接调节MCF7细胞对雌激素（E2）的反应性，从而增强雌激素受体α 的表达[14]，通过下调雌激素合成关键酶—芳香化酶表达而抑制雌激素的分泌[15]。

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