锚蛋白重复序列和细胞因子信号传导抑制因子盒蛋白（Ankyrin SOCS box, ASBs）,作为泛素连接酶，在泛素化介导的蛋白水解途径中是非常重要的。然而，ASB7在减数分裂中的功能仍然在探索阶段。为了研究ASB7在小鼠卵母细胞成熟中的功能，我们先通过免疫荧光染色发现ASB7在卵母细胞成熟过程中均与细胞核共定位，然后通过显微注射ASB7的特异siRNA来抑制ASB7的表达水平，研究发现敲低ASB7后的小鼠卵母细胞在减数分裂过程中成熟率显著降低，并出现了高频率的第一极体不能排出和卵母细胞对称分裂现象。最后我们还观察到ASB7降低的卵母细胞中纺锤体组装缺陷和染色体排列异常的比例亦显著增加，进而导致细胞无法正常分裂。我们的实验可以推测出敲低ASB7阻碍了卵母细胞中ASB7靶蛋白的泛素化和降解，进而导致了错误的染色体排列和纺锤体异常。以上结果表明ASB7在小鼠卵母细胞的成熟和减数分裂中是不可或缺的，卵母细胞的成熟是一个由多种蛋白参与调控的复杂过程。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1．1 实验材料 2
1．1．1 实验动物 2
1．1．3 主要试剂及其配制 3
1．2 实验方法 3
1．2．1 小鼠卵母细胞的获取及培养 3
1．2．2 免疫荧光染色方法 4
1．2．3 ASB7siRNA显微注射 4
1．2．4 Western bolt（免疫印迹试验） 5
1．2．5 数据分析 5
2 结果与分析 5
2．1 ASB7在卵母细胞成熟过程中的定位 5
2．2 ASB7敲低对卵母细胞体外成熟的影响 6
2．3 ASB7敲低对纺锤体和染色体的影响 7
3 讨论 8
致谢 8
参考文献 9
ASB7在小鼠卵母细胞成熟中的作用
引言
卵母细胞发育是雌性生殖过程的极为重要环节之一，对卵母细胞的研究也是胚胎工程中极为重要的课题之一。卵母细胞成熟经历通过减数分裂 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: @351916072@ 
、生殖泡消失、排出极体等许多生理反应变化与分子调节等过程，才能得到受精和生长成独立个体的潜能。当卵母细胞在各种异常情况下导致上述成熟过程无法正常进行时，卵母细胞不能正常成熟，以至于无法成功受精，在其成熟过程中很多卵母细胞的质量低下。得到质量优良的成熟卵母细胞是细胞的体外受精和形成遗传发育潜能高的胚胎的重要前提，随着科研人员深入研究调控卵母细胞发育的分子机制，我们可以在提高家畜繁殖率和增加畜牧业经济效益上做出较大的贡献，并且可以进一步的研究如何改善人类生殖健康状况，为人类的遗传发展做出贡献。因此，我们对卵母细胞的质量越来越重视，并展开了一系列对卵母细胞的研究。
卵母细胞的成熟包括核成熟,胞质成熟和核质成熟的协同性三个方面[1]。卵母细胞在成熟之前需要经历复杂的减数分裂时期，减数分裂分为前期 (GV期) 、生发泡破裂期 (GVBD) 、第1次减数分裂中期 (metaphase Ⅰ, MⅠ) 、第1次减数分裂后期 (anaphase Ⅰ, AnaⅠ) 和第1次减数分裂末期 (telophase Ⅰ, TelⅠ)、第2次减数分裂中期[2]。卵原细胞在增殖结束之后，逐渐获得向初级卵母细胞发育的能力，经过第一次减数分裂前期的细线期、偶线期、粗线期，多数卵母细胞停滞在第一次减数分裂前期的双线期，等待FSH和LH的激素峰，这个也被称作生发泡期，细胞在这个阶段的生长是非常缓慢的。随着优势卵泡的发育成熟，其卵母细胞从核网期的减数分裂停滞过程中恢复，表现为核崩解，即生发泡破裂[3]（germinal vesicle breakdown, GVBD），生发泡破裂之后，卵母细胞周围的卵丘细胞扩展，伴随着纺锤体微管的组装，纺锤体形成。同时排出第一极体，标志着第一次减数分裂的完成[4]。在这之后，卵母细胞继续发育进入第二次减数分裂，如果没有精子进入或孤雌激活，将停滞于第二次成熟分裂的中期，其过程类似于有丝分裂过程，但在赤道板上，每个染色体中的两个染色单体被纺锤丝朝两个方向牵引，发育到此即标志着卵母细胞核成熟。卵母细胞胞质成熟的过程是极为复杂的，包括 mRNA转录和蛋白的翻译修饰，细胞器的功能及重分布等，由多个蛋白参与调控，对于后续的受精和早期胚胎发育起着决定性的作用。
锚蛋白重复序列和细胞因子信号传导抑制因子盒蛋白（Ankyrin SOCS box, ASBs）在真核生物中是最大的SOCS盒蛋白家族，有18个成员（ASB118）。大多数ASB蛋白被定义为E3泛素连接酶，因为它们含有用于底物识别的SOCS盒结构域，形成ElonginCullinSOCS（ECS）复合物的子集[5]。这些蛋白质都含有两个功能结构域：C末端SOCS盒，其充当适配器，为其提供连接，还有可变数目的N末端锚蛋白重复序列，其参与特定的蛋白质 蛋白质相互作用[6,7,8],锚蛋白重复区域靶向蛋白质的降解。研究表明ASB在调节不同脊椎动物的各种系统中的正常和病理条件中的作用。锚蛋白重复序列和细胞因子信号传导抑制因子（SOCS）盒蛋白（ankyrin repeat and SOCS box containing protein）是涉及多种生物过程的大蛋白家族，包括增殖和分化的调节。SOCS盒的ASB蛋白在泛素化介导的蛋白水解途径中是即为重要的[9,10]。从相互作用的蛋白质 蛋白质数据库中观察发现，在整个ASB家族中仅ASB7具有直接的蛋白质 蛋白质相互作用。ASB7可能在perk信号传递中起重要作用。使用PERK抑制剂对PERK通路的抑制作用让用TUN处理细胞的ASB7蛋白水平略有降低。ASB7的Cullin 5相互作用抑制因子泛素化DDA3，这是一种纺锤体动力学的调节因子，通过靶向DDA3蛋白酶体降解。微管（MT）的存在阻止了ASB7DDA3的相互作用，从而稳定了DDA3。ASB7的敲减降低了MT聚合并增加了具有未对齐染色体的细胞的比例，并且通过缺失DDA3来挽救该表型。总的来说，ASB7通过控制DDA3的表达在调节纺锤体动力学和基因组完整性中起着至关重要的作用。DDA3被ASB7靶向用于蛋白酶体降解，ASB7多聚泛素化DDA3同时在体内和体外。更重要的是，ASB7的敲除阻止了MT聚合并增加了具有未对齐染色体的细胞的比例，ASB7的敲除使细胞中DDA3的消耗恢复了这些表型，ASB7通过调节DDA3的水平来调节纺锤体动力学和基因组完整性。然而，在ER应激诱导的细胞死亡中，敲减ASB7并不能影响HeLa细胞的存活，原因可能是仅抑制ASB7基因不足以保护内质网应激时的HeLa细胞。目前对ASB成员作为ECS复合体基板识别元件的功能认识有限。ASB7是一种泛素连接酶，可以激活DDA3的泛素化和降解[11]。然而，ASB7在减数分裂中的功能仍然在探索阶段。我们的研究将通过敲低ASB7的表达来研究了ASB7在小鼠卵母细胞中的作用。
1 材料与方法
1．1 实验材料
其中包括实验仪器、实验动物和主要试剂及其配制。

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