目录
摘要 1
关键词 1
ABSTRACT 1
KEY WORDS 1
引言 1
1 材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1 抗体与试剂 3
1.1.2 主要仪器设备 4
1.1.3 抗体和试剂的配制 4
1.2 方法 5
1.2.1 小鼠卵母细胞采集与培养 5
1.2.2 确定ARF GAP1抑制剂（QS11）浓度 5
1.2.3 蛋白质免疫印迹 5
1.2.4 免疫荧光染色 6
1.2.5 细胞活染 6
1.2.6 数据处理与分析 7
2结果与分析 7
2.1 ARF GAP1在卵母细胞成熟过程中的表达与定位 7
2.2 ARF GAP1表达抑制导致生发泡破裂受阻 8
2.3 ARF GAP1表达抑制导致极体排出受阻和细胞周期紊乱 9
2.4 ARF GAP1表达抑制导致皮质部微丝组装障碍 10
2.5 ARF GAP1表达抑制导致内质网、高尔基体功能障碍 11
3 讨论 12
致谢 13
参考文献: 14
ARF GAP1在卵母细胞成熟中的作用
摘要
卵母细胞成熟是受精和早期胚胎发育的先决条件，卵母细胞成熟障碍会引起流产、胎儿死亡及出生缺陷等，直接关系到畜牧业生产，并对经济效益产生影响，因此研究卵母细胞成熟的分子调控机制具有重要理论意义。ADPRibosylation Factor 1（ARF1）属于小GTP酶的Ras超家族，需要GTP水解后发挥功能，但其本身缺乏GTP酶活性，而ARF GTP酶活化蛋白1（ARF GAP1）通过诱导与ARF1蛋白结合的GTP的水解来控制ARF1的GTP结合蛋白的活性。已有研究证明ARF1的表达抑制会使卵母细胞减数分裂异常，但是ARF GAP1对卵母细胞调控作用机理仍是未知的。据研究，我们发现ARF GAP1在卵母细胞成熟的各个时期 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072# 
均表达，且定位于囊泡。ARF GAP1表达抑制（QS11处理）后，卵母细胞生发泡破裂受阻，极体排出率下降，细胞周期紊乱。我们还发现在QS11处理的卵母细胞中皮质部微丝信号减弱，表明ARF GAP1影响卵母细胞皮质部微丝组装。此外，QS11处理的卵母细胞中内质网和高尔基体信号减弱，表明ARF GAP1影响卵母细胞内质网和高尔基体的功能。总之，我们的结果表明ARF GAP1在卵母细胞成熟中发挥重要作用。
引言
哺乳动物卵母细胞成熟质量低下是制约现代畜牧业发展的重要原因之一，卵母细胞成熟过程中的任何环节出现错误都会导致卵母细胞成熟障碍，通常伴随流产、胎儿死亡及出生缺陷等，直接关系到畜牧业生产，并对经济效益产生影响。虽然已有许多卵母细胞成熟相关调控分子的报道，但参与卵母细胞成熟的因子和调控机制仍大量未知。因此，探索这些未知因子和调控机制有助于提高卵母细胞成熟质量，具有重要理论意义[1]。
哺乳动物卵母细胞成熟是一个多阶段的复杂过程，正常的细胞周期是卵母细胞成熟的前提。初级卵母细胞停滞在第一次减数分裂前期的双线期时，核位于细胞中央位置，又称生发泡（GV）[2]。当促黄体生成激素（LH）在排卵前激增时，减数分裂的恢复以生发泡破裂（GVBD）为标志。然后，卵母细胞经历减数第一次分裂中期I（MI），伴随着染色体周围的微管组装，并形成双极减数分裂纺锤体。卵母细胞释放出第一极体（PbI）后停滞在第二次减数分裂中期II（MII），经受精或孤雌生殖后，排出第二极体[3]。
微丝是细胞骨架的主要成分，在卵母细胞成熟中发挥重要作用。微丝不仅能调控皮质极性的形成，而且能够调控胞质分裂过程。肌动蛋白纤维的密集细胞质网状结构控制着第一次减数分裂纺锤体向皮质的转运[4]。内质网（ER）和高尔基体（Golgi）是负责蛋白质合成和传递的主要细胞内细胞器。功能蛋白必须在内质网中正确折叠，以维持卵母细胞的发育，而任何细胞分裂都与高尔基小泡的分裂和运动有关[5]。此外，微丝与内质网和高尔基体之间也存在着密不可分的关系。微丝骨架有助于胞质分裂结束时内质网的扩散，即分泌囊泡从内质网至高尔基体的转运[6]。分泌囊泡脱离高尔基体后继续向细胞质膜转运，微丝的过量聚合将导致分泌囊泡向质膜运输而不在高尔基体附近聚集[7]。
二磷酸腺苷核糖基化因子1( ADPribosylation factor 1, ARF1 )是ARF家族中的一员，属于小GTP酶的Ras超家族[8]，在哺乳动物细胞中普遍表达，最初被鉴定为霍乱毒素对腺苷酸环化酶激活剂Gsa的ADP核糖基化所需的蛋白质因子。ARF1的一个显著特征是存在豆蔻酰化的N末端两亲性螺旋。在GTP结合后，该螺旋插入脂质双层，使膜相连接[9]。因此，除了开关区域的变化之外，GTP结合形式的ARFs的构象发生第二次变化，这是由于交换间区域移动到疏水端，而疏水端包含GDP结合形式的两亲性螺旋。ARF1的功能复杂多样，能够调节囊泡运输和细胞器结构[10]，参与磷脂代谢，调节膜表面的微丝细胞骨架，且在在内质网（ER）和高尔基体（Golgi）之间的膜运输中起重要作用[11]。
ARF1需要GTP水解后发挥功能，但其本身缺乏GTP酶活性，而ARF GTP酶活化蛋白（ARF GAPs）是一组多功能且多样化的多域蛋白，可以组装信号复合物，它们通过诱导与ARF蛋白结合的GTP的水解来控制ARF家族的GTP结合蛋白的活性[12]。在过去，G蛋白活性被视为线性信号传导途径，GAPs被认为是“灭活器”。然而，近十年对ARF蛋白的研究表明，它们的信号传导更复杂，GAPs可以启动它们自身的生理反应。ARF蛋白在内质网高尔基体系和细胞质膜中成对或串联起作用，那么GAPs如何作为效应物和启动信号参与细胞过程有待研究[13]。ARF GAP1是第一个被克隆的ARF1导向的GTP酶活化蛋白，ARF GAP1与ARF1的复合物可被视为功能性GTP酶，其基本上由异二聚体组成，具有催化活性[14]，它通过诱导与ARF1结合的GTP水解来调节内质网和高尔基体之间的膜泡运输[15]。此外，它能够调节膜和微丝细胞骨架的重塑，还可以与脂质结合，并且在囊泡存在时其活性达到最大。已有研究证明ARF1是一种在真核细胞中存在的单体GTP结合蛋白，能激活ADP核糖基化转移酶，ARF1的表达抑制会使小鼠卵母细胞减数分裂异常[16]，但是很少有研究ARF GAP1在生殖系统中的作用，特别是对ARF GAP1影响卵母细胞成熟的机制。

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