新型四环素失活酶机制研究【字数：7036】
me as the estimated result. The purified protein obtained by washing with imidazole of different concentration, and the best one was obtained by washing at 100 mM of imidazole. The results show that this heterologous expression method is feasible and can provide materials for the follow-up study of inactivated enzymes. 四环素类抗生素（Tetracyclines, TCs）为一类广谱抗生素[1]，因其价格低廉且副作用小[2]，对革兰氏阳性菌、阴性菌、支原体、衣原体等都有非常好的抑制作用，自发明以来在人和动物的细菌感染性疾病的治疗中发挥了重要的作用。同时，四环素类药物还作为促生长剂在在水产及畜牧养殖业中大量使用。发达国家例如日本，在 2005-2010年中四环素类使用量占总使用量的一半[4]，欧共体的消耗量则达到每年 2300吨[5]。 过度使用的筛选压力导致的抗生素耐药性以及耐药基因产生并且大量传播 [6,7]。近年来，耐药基因在土壤[8]、生物体内[9]、河流[10]、海洋[11]中被频繁检出，任由这些基因在环境中传播，最终将危害到我们人类自身健康。为了解决这个问题，近年来对耐药性机制的研究越来越多，其中最常见的是外排泵机制和核糖体保护作用机制。而第三种耐药机也被发现，为钝化酶失活机制[12,13]。 四环素钝化酶通过化学修饰使四环素失活， tet(X)是目前唯一在临床上发现的四环素钝化酶基因。对这个基因的体外和体外反应活性、作用机制及产物的结构已有较为透彻的研究，可为其他机制尚不明确的钝化酶基因的研究提供必要的参考。 研究表明，大部分微生物是无法在实验室中进行培养的，这些不可培微生物中有包含很多未知的耐药性基因[14,15]，为研究带来困难。随着现代技术的发展，临床医学和畜牧业中的耐药基因来源于土壤被得以证实[16,17]，人们随后将视线转移到土壤环境中，宏基因组学横空出世。这种方法打破了微生物培养研究的局限性，越来越多的耐药基因得以被发现以及研究。2015年Dantus等人从土壤宏基因组文库中获得9个新型的四环素钝化酶基因 tet(47 ~ 55)[18-21]。本实验室也利用功能宏基因组学筛选的方法从珠穆朗玛峰土壤宏基因组文库中筛选得到2 个四环素钝化酶基因，可介导较高水平的四环素耐药性（64 μg/mL）。与tet（X）的序列相似性仅21%，与土壤中发现的9个钝化酶基因的序列相似性也均低于60%，我们将这两个新型基因分别命名为MQ776 和MQ1435。 本实验将会把发掘出的基因进行质粒重组、异源表达。将诱导分化产物收集后进行纯化鉴定。1 实验材料1.1实验材料四环素耐药阳性亚克隆菌株；MQ1435, MQ776；菌株感受态细胞 Escherichia. coli E. coli EPI100TM-T1R，感受态细胞 E. coli BL21 (DE3)；载体pTG19-T 购自上海捷瑞生物有限公司；pET-30a(+) 本实验室保存；镍离子亲和层析柱，购自上海生工生物有限公司。1.2试剂与仪器1.2.1试剂与酶氨苄青霉素(Ampicilin)100mg/mL上海捷瑞生物有限公司卡那霉素（Kanamycin）30mg/mL上海捷瑞生物有限公司溴化乙锭（EB）上海捷瑞生物有限公司胰蛋白胨（Barton-Tryptone）上海生工生物有限公司氯化钠（NaCl）上海生工生物有限公司酵母提取物上海生工生物有限公司咪唑（Imidazole）上海生工生物有限公司蛋白 Marker上海生工生物有限公司IPTG（Isopropyl β-D-Thiogalactoside）上海生工生物有限公司十二烷基磺酸钠（SDS）上海生工生物有限公司氯化镍（NiCl2）上海生工生物有限公司Tris上海生工生物有限公司1% Triton X-100上海生工生物有限公司5×蛋白质加样缓冲液上海生工生物有限公司琼脂粉（Ager Powder）上海生工生物有限公司PMSF（Phenylmethanesulfonyl fluoride）Solarbio考马斯亮蓝（coomassie blue staining）SolarbioAcr/BisSolarbioTEMEDSolarbioAPSSolarbioPfu DNA Polymerase赛默飞世尔科技（中国）有限公司Nde Ⅰ赛默飞世尔科技（中国）有限公司Xho Ⅰ赛默飞世尔科技（中国）有限公司Bam HI赛默飞世尔科技（中国）有限公司T4 DNA Ligase赛默飞世尔科技（中国）有限公司质粒小量提取试剂盒天根（TIANGEN）有限公司质粒小提中量试剂盒天根（TIANGEN）有限公司琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒天根（TIANGEN）有限公司四环素上海阿拉丁生化科技股份有限公司无水乙醇上海凌峰化学试剂有限公司琼脂糖上海栩圣生物科技有限公司盐酸（HCl）南京杰汶达生物科技有限公司氢氧化钠(NaOH)西陇化工股份有限公司甘氨酸（Glycine）北京博奥拓达科技有限公司丙三醇南京化工试剂有限公司冰醋酸（CH3COOH）广东省化学试剂工程技术研究开发中心1.2.2实验仪器SW-CJ-1FD 超净工作台苏州苏洁净化设备有限公司UV-2600 系列紫外可见分光光度计上海尤尼柯仪器有限公司DYY-6C 型电泳仪北京市六一仪器厂热恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司HZ 系列 HYG-C 摇床太仓市实验设备厂电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司DW-YL270 型-20 ℃冰箱中科美菱YC-CJ-1FD 型 4 ℃冰箱中科美菱IMS-70 型雪科全自动雪花制冰机北京泰泽嘉业科技发展有限公司CT15RT 高速冷冻离心机上海天美科学仪器有限公司立式压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂HEMA PCR 扩增仪珠海黑马医学仪器有限公司金属浴美国 Major ScienceMicroPulser 电穿孔仪美国 BIO-RADWIGGENS PH610 台式酸度计北京桑翌实验仪器研究所Sartorius AG1-14 型离心机德国 SigmaSL2001N 型电子天平上海民桥精密科学仪器有限公司XO-1000D 超声细胞破碎仪南京先欧仪器制造有限公司2 实验步骤与方法2.1 四环素钝化酶基因引物的设计根据目的基因序列设计特异扩增引物，并选择表达载体 pET-30a(+) 上Nde Ⅰ 和 Xho Ⅰ两个酶切位点加入特异引物两端。扩增引物序列以及酶切位点如表 2-1 所示 表2-1 MQ776 和 MQ1435 的引物设计 引物名称引物核苷酸序列 5′-3′酶切位点F-Nde Ⅰ-MQ-14355’-ggaattccatatgtctgctacaaataaaattctcgtNde ⅠR-Xho Ⅰ-MQ-14355’-ccgctcgagtcttttcataatctggcaaagaaatggXho ⅠF-Nde Ⅰ-MQ-7765’-ggaattccatatgtctactgtaaataaaattctcgtgNde ⅠR-Xho Ⅰ-MQ-7765’-ccgctcgagtttcatactctggtaaggaaattgXho Ⅰ注下划线表示 NdeⅠ和 XhoⅠ酶切位点，粗体表示起始密码子。2.2 目的基因的扩增分别将亚克隆质粒 MQ776和MQ1435作为模板，用高保真 pfu polymase 进行 PCR（聚合酶链式反应）扩增反应体系如表 2-2 所示表 2-2 PCR 扩增反应体系体系组分体积/μLpfu polymase0.5pfu buffer (+ MgSO4)3.0dNTP (10 mM)0.7primer F1.0primer R1.0Template1.0DMSO1.25ddH2O16.55总体积20体系中各成分都加入后，混匀各成分，放入PCR 仪中进行扩增，PCR 的扩增程序如表 2-3所示表 2-3 PCR 扩增程序PCR运行参数第一节95 ℃，5 min第二节94 ℃，40 s65 ℃ - 55 ℃，40 s10 个循环72 ℃，2 min第三节94 ℃，40 s55 ℃，40 s25 个循环72 ℃，2 min第四节72 ℃，10 min 制备含有 0.5 μg/mL 的EB的琼脂糖凝胶（浓度为 1%）称取0.5g琼脂粉，加入 50mL缓冲液，加热溶解后待温度稍降加入EB，混匀倒入模具中，插上梳子。带凝固后取下梳子，取出胶块。将得到的 PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 120V，60 min。切下目的条带的胶条，用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回收 PCR 产物，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测回收产物。2.3 目的基因的酶切上一步回收到的产物用 Nde Ⅰ 和 Xho Ⅰ 进行酶切反应，酶切体系如表 2-4 所示表 2-4 PCR 产物的酶切体系体系组分体积/μLNde Ⅰ2.0Xho Ⅰ1.510 х FD Green Buffer5.0目的片段16.0ddH2O25.5总体积50用含有 0.5 μg/mL 溴化乙锭的 1%琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，切下目的条带，用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回收酶切产物，对回收产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳验证。2.4 表达载体 pET-30a(+)的酶切对表达载体 pET-30a(+) 用 Nde Ⅰ 和 Xho Ⅰ 进行酶切反应，37 ℃条件下反应 2 h，酶切体系如表 2-5 所示表 2-5 pET-30a(+)质粒的酶切体系 体系组分体积/μLNde Ⅰ2.0Xho Ⅰ1.510 х FD Green Buffer5.0pET-30a (+)14.0ddH2O27.5总体积50用凝胶电泳法检测酶切产物，步骤同上。切下目的条带，用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回收酶切产物，对回收产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳检测。2.5 连接反应 使用 T4 DNA Ligase 连接制备好的目的片段与载体进行连接，连接体系如表 2-6 所示表 2-6 连接反应体系体系组分体积/μLT4 DNA Ligase0.510хT4 DNA Ligase Buffer1.0pET-30a(+)酶切片段4.0目的片段4.0ddH2O0.5总体积10将制备好的连接体系混匀置于 4℃ 的环境下连接 16 h后， 65℃ 加热灭活20 min。为减少体系中的盐离子，提高电击转化效率，需对反应体系进行脱盐，操作如下配制脱盐凝胶称取葡萄糖 0.9g ，琼脂糖 0.5g ，将其全部溶于 50mL 超纯水中，放到微波炉里加热使其呈澄清透明后取出，冷却至 60 ℃左右时，从中取 800μL 置于规格为 1.5 mL的 EP管中，待凝胶将要凝固时，用 0.5 mL EP 管从凝胶表面垂直按下。当至凝胶凝固后，取出0.5 mL EP 管，这时管中凝胶就形成了一个光滑的凹槽；2）脱盐将灭活后的连接产物冷却后，加入到凹槽中，将EP管放置于冰上，进行冰上脱盐，时间约为 1h；2.6 转化 脱盐完成后，将连接体系电转化转入到感受态细胞 EPI100 中，用37 ℃，225 rpm 的摇床上活化 1-1.5 h。因pET-30a(+) 的抗性为 Kan，浓度为 30 μg/mL，所以将活化后的菌液涂布到含 30 μg/mL Kan 和 10 μg/mL Tet 的固体 LB 平板中，37 ℃条件下恒温培养 18-24 h进行选择培养（具体培养时间按照菌落生长情况调整），平板上长出来的克隆即为为重组克隆，挑取平板上的克隆于含 30 μg/mL Kana 和 10 μg/mL Tet 的液体 LB 培养基中过夜培养，后用质粒小提试剂盒进行提取，实验基本步骤如下1) 吸取培养好的菌液，加入离心管中，使用离心机12000 rpm离心1min，弃上清。2) 向留有菌体沉淀的离心管中加入P1，吹吸悬浮细菌沉淀，使沉淀充分溶解。3) 向离心管中加入P2，温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解。4) 向离心管中加入P3，立即缓慢地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。使用离心机12000 rpm离心10min，弃沉淀保留上清液。5) 离心过程中，来平衡平衡柱子向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入500mL 的平衡液BL，12000 rpm离心1min，倒掉废液将吸附柱重新放回收集管中待用。6) 将上一步收集的上清液用移液枪转移到吸附柱中（注意尽量不要吸出沉淀），吸附30min，12000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。7) 向吸附柱中加入500mL 去蛋白液PD，12000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。8) 向吸附柱中加入漂洗液PW，12000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放入收集管中。9) 重复步骤8）。10) 将吸附柱放入收集管中，12000 rpm离心2min，为了将吸附柱中的漂洗液去除。将吸附柱盖子打开，在室温放置30min，彻底吹干乙醇。11) 将吸附柱置于一个干净的收集管中，向吸附膜的中间部位滴加洗脱缓冲液，放置于37℃ 金属浴5min，12000 rp离心2min 将质粒溶液收集到离心管中。12) 将质粒溶液重新吸取入新的1.5mL EP管中，编号保存。一部分质粒用 Nde Ⅰ 和 Xho Ⅰ 进行酶切鉴定，方法同步骤2.4然后用 1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，若片段大小正确，送到南京金斯瑞生物科技有限公司测序。若测序结果正确，则进行后续操作。2.7 感受态细胞 E.coli BL21 的制备 实验中选取 E. coli BL21（简称 BL21）作为表达宿主，BL21感受态细胞的制备过程为1）取-80℃冰箱保存的 BL21 菌种在固体 LB 平板上划线，37 ℃条件培养 18-20 h。挑取平板上的单菌落接种于 10 mL 的液体 LB 培养基中，用37 ℃、225 rpm 条件的摇床培养过夜;2）取过夜菌液按照 1%的接种量转接到 1 个 400 mL YENB 培养基中，扩大培养，用条件为37 ℃、200 rpm 摇床培养至 OD600 值为 0.4-0.6，此时的菌体生长状态比较好；3）将菌液倒入 2 个预冷的 250 mL 的灭菌的离心瓶中，放入冰水中预冷；4）离心机预冷至 4 ℃，将预冷的菌液放入离心机中，4000 rpm 离心 10 min，收集菌体，弃掉上清；5）用 100 mL 预冷的灭菌二次水重悬菌体，4000 rpm 离心 10 min，收集菌体，弃掉上清；6）重复步骤5）；7）用 100 mL 预冷的灭菌 20%甘油重悬菌体，4000 rpm 离心 10 min，收集菌体，弃掉上清；8）重复步骤7）；9）用 1-2 mL 预冷的灭菌 20%甘油重悬菌体，将菌液按照每 50 μL 分装到预冷好的 1.5 mL EP管中，-80 ℃条件保存备用。2.8钝化酶的异源表达将重组的表达菌株和对照菌株同时进行诱导表达。对照菌株为表达载体质粒 pET-30a(+)转入到感受态细胞 BL21 中。将连有目的片段的表达载体 pET-30a(+)转入到感受态细胞 BL21 中，步骤同2.6。异源表达的步骤为1）将重组的表达菌株划线在含 30 μg/mL Kan 和 10 μg/mL Tet 的固体 LB 平板上， 37 ℃过夜培养，挑取平板上的单克隆接种到含 30 μg/mL Kan 和 10 μg/mL Tet 的液体2）按 1‰的菌液接种量进行接种，取 400 μL 菌液转接入 400 mL 含 50 μg/mL Kan的液体 LB 培养基中，37 ℃，220 rpm 摇床培养，菌体生长过程中随时观察菌体的生长状况，培养 3-3.5 h 后，用紫外分光光度计检测 OD600 值为 0.6-0.8，菌体生长达到对数期，此时菌体的生长状态达到最佳时期。3）向培养液中加入终浓度为 0.1 mM 的诱导剂 IPTG 进行诱导，诱导条件18 ℃、200 rpm 诱导 18-20 h。2.9钝化酶的纯化取诱导表达后的发酵液进行条件为 4000 rpm、25 min 的低温高速离心，并收集菌体（沉淀）。向菌体内加入裂解液 10 mL，蛋白酶抑制剂（PMSF）100 μL，混匀后进行超声破碎，按照破碎 2.5 s，停止 1.5 s的方法进行超声 20 min。然后将产物在 4 ℃、12000 rpm 的条件下离心 30 min，收集上清液和部分沉淀。使用偶联镍离子亲和层析柱对上清液进行纯化。步骤如下1）填料装柱用镊子取出上层垫片，填料倒入盛有少量超纯水的干净的烧杯中超声 10 min，然后将填料填回柱子中，排除气泡，将垫片放回。2）平衡用 5 个柱体积的 500 mM 咪唑溶液冲洗柱子，去除杂质；然后用 5 个柱体积的 Washing Buffer 平衡柱子。3）用一定体积的 50 mM NiCl2 处理柱子至流出的液体呈绿色，这是为了使镍离子与填料结合，然后用一定体积的超纯水冲洗多余的镍离子，并再次用 Washing Buffer 平衡柱子。4）上样将离心后的上清液加入到柱子中。5）冲洗杂质用 12 个柱体积的 Washing Buffer 冲洗样液中的杂质，至 OD280 值小于 0.1为止。6）收集蛋白用 50 mM 的咪唑洗去杂蛋白，然后用 500 mM 的咪唑洗出目的蛋白，收集到预冷好的 2 mL EP 管中，每管收集 1 mL ,收集 12-16 管，测 OD280值。将收集好的蛋白用甘油保存，冷藏于-80℃冰箱中备用。7）保存柱子分别用 5 个柱体积的 500 mM 的咪唑和 5 个柱体积的超纯水冲洗柱子，然后用 3 个柱体积的 20%乙醇冲洗柱子，4 ℃的条件下保存好。2.10钝化酶的鉴定 根据测得的碱基序列，计算氨基酸数，预测目的蛋白分子量大小，并根据预测的分子量大小选择合适的浓度的聚丙烯酰胺分离胶及浓缩胶，来进行 SDS-PAGE 电泳检测。步骤如下1）检漏将两块玻璃板合在一起，两边夹住，向玻璃缝隙中加满水，于37 ℃环境下，静置 10 min 后观察液面，若没有变化，则说明玻璃板缝隙不漏，可以进行下一步操作；2）配制分离胶配制分离胶的浓度为 10%，配方如表 2-7 所示表 2-7 10%分离胶的配制体系试剂体积/μLddH2O81001.5 mol/L Tris-HCl (pH8.8)500010% (W/V) SDS200Acr/Bis (30%)6650TEMED1010% Aps100总体积20000将各成分混匀后，倒入到玻璃板缝隙中至一定的高度，然后倒入一层 ddH2O来保持液面的平整以及防止空气进入，置于 37℃的条件下放置40 min，待胶面与水层之间有一条明显的界限后，倒去上层液体；3）配制浓缩胶配制浓度为 5%的浓缩胶，配方如表 2-8 所示表 2-8 5%浓缩胶的配制体系试剂体积/μLddH2O21000.5 mol/L Tris-HCl (pH6.8)38010% (W/V) SDS30Acr/Bis (30%)500TEMED410% Aps30总体积3044 将各组分混匀之后倒入到玻璃缝隙中，放上梳子，于 37℃条件下静置 30 min，形成胶孔；4）处理样品取 10 μL 样品（上清液和沉淀均要检测），10 μL 5×Loading(溴酚蓝)，加水至 50 μL，99 ℃加热10 min，使蛋白质变性；5）电泳检测进行 SDS-PAGE电泳检测时蛋白 Marker 上样量为 10 μL，样品的上样量为 20 μL。首先将电压调整为 80 V，待蓝色条带至分离胶与浓缩胶的分界处形成一条直线时，将电压增加至100 V开始电泳，时间为 2 h。6）染色、脱色胶块用考马斯亮蓝染色 40 min，用脱色液脱色 1 h，期间每隔 40 min更换脱色液，共 2 次，最后用 ddH2O 脱色过夜；7）观察过夜脱色后的胶块取出，确定目的蛋白的条带的大小及蛋白的纯化效果。3 实验结果与分析3.1 目的基因的扩增以耐药阳性亚克隆质粒 MQ776、MQ1435 为模板，PCR 扩增目的基因，1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图 3-1 所示图 3-1钝化酶基因的 PCR 产物电泳图注MMarker ; 1 MQ776 PCR 产物; 2 MQ1435 PCR 产物3.2 目的基因的酶切用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回收 PCR 扩增的目的条带，然后将回收的产物用Nde Ⅰ和 Xho Ⅰ进行酶切，对酶切产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收酶切产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图 3-2 所示图3-2化酶基因PCR产物酶切验证电泳图注MMarker ; 1MQ776 PCR 产物的酶切胶回收产物 ; 2MQ1435 PCR 产物的酶切胶回收产物3.3 表达载体 pET-30a(+)的酶切提取pET-30a(+)质粒，1%琼脂糖凝胶电泳检测，pET-30a(+)质粒为 5422 bp，如图 3-3所示图3-3 pET-30a(+)质粒电泳图注MMarker ; 1 pET-30a(+)质粒用 Nde Ⅰ和 Xho Ⅰ对 pET-30a(+)质粒进行酶切，回收酶切产物，并用琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图 3-4 所示图3-4 pET-30a(+)用 Nde Ⅰ和 Xho Ⅰ酶切后的胶回收产物电泳图注M Marker ; 1pET-30a(+)酶切后胶回收产物3.4 转化T4 DNA Ligase 连接制备好的目的片段与载体，经电转化转入克隆宿主 EPI100中，经平板筛选获得重组菌株，提取质粒，进行酶切验证，若片段大小正确，送到南京金斯瑞生物科技有限公司测序。若测序结果正确，将重组质粒转入到表达宿主细胞E. coli BL21 中，经平板筛选获得重组表达菌株。3.5 四环素钝化酶的诱导表达与纯化对重组表达菌株进行诱导表达，400 mL 的发酵液经 0.1 mM 的诱导剂 IPTG 进行诱导，18 ℃、200 rpm 诱导 18-20 h，收集菌体，经裂解、超声破碎，得到粗酶，然后经镍离子亲和层析柱纯化，获得纯化后的酶，用 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化后的酶的大小及纯度。3.6 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测步骤2.9中纯化得到的酶，经 One Drop 测定 OD280 值，获得酶的量分别为MQ776 为 2 mg，MQ1435 为 20 mg。用 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化后的目的蛋白，结果如图3-5、3-6所示图3-5 MQ1435 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳图 注M蛋白 Marker ; 1已纯化的酶 MQ1435图3-6 MQ776 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳图注M蛋白 Marker ; 1已纯化的酶 MQ776经计算，MQ1435 预测的酶的分子量约为 42.6 KDa，MQ776 预测的酶的分子量约为 41.8 KDa。SDS-PAGE 电泳结果显示，MQ1435 和 MQ776 的目的条带的分子量大小与预测的酶的分子量大小基本一致。MQ1435 的条带单一；MQ776 的蛋白条带较多，目的条带不明显。4讨论 一个完整的异源表达系统包括匹配的表达载体和表达宿主。 E.coli 是最为常用的一种原核表达系统，本实验采用的是 E. coli BL21(BL21)（DE3）作为异源表达的宿主，pET-30a(+)作为表达载体。这样选择是因为 E. coli BL21 宿主细胞中没有可降解外源重组蛋白的蛋白酶，另外，BL21 中有 T7 聚合酶基因，而表达载体 pET-30a(+)上含有 T7 启动子，二者结合，理论上可以使蛋白表达更稳定，表达量更高。 钝化酶的诱导表达中采用的诱导剂是 IPTG ，它的作用是诱导目的蛋白的表达。原因是它不会被细胞代谢，能稳定存在于细胞中，且它通过与阻遏蛋白的结合来改变阻遏蛋白的构象，阻止其与 E. coli 中的操作基因 O 结合，形成的结合物从操作基因 O 上解离出来，从而促使转录反应正常进行，保证目的蛋白表达。但 IPTG 的添加量、诱导温度和时间等非常影响酶的表达效果，本实验经过探索，发现 IPTG 在温度 18 ℃、转速 200 rpm、诱导时间 18-20 h 时酶的表达效果相对较好，其中低温诱导是为了使蛋白能正确盘曲折叠，形成稳定的结构。不过目的蛋白的含量还是未达到预期标准，后续实验应将重点放在摸索更完善的IPTG最适条件上，可以表达出更多目的蛋白，方便后续体外活性验证。本实验采用的粗酶纯化方式是用镍离子亲和层析柱纯化目的蛋白，原理是配体与基质共价结合形成亲和吸附剂，表达后的目的蛋白含组氨酸（His）标签，His 与配体 Ni2+ 可逆性吸附，从而使目的蛋白与其它蛋白分离，最后用一定浓度的咪唑进行洗脱，解除吸附，得到纯度较高的目的蛋白。MQ1435 表达出来的酶浓度高、纯度较好，并且表达量较高，纯化效果显著；而 MQ776 表达出来的酶浓度低，且纯化效果不好。MQ776 诱导表达之后的细胞经破碎后的沉淀用 SDS-PAGE 电泳检测，没有目的条带，说明酶并没有在沉淀中，对其序列分析是否有信号肽及跨膜蛋白，经分析，未发现信号肽及跨膜蛋白存在。后期希望通过改变诱导表达的条件、更换不同的表达载体及表达宿主、使用伴侣蛋白等来提高酶的表达量。致谢感谢雷蕾师姐给予我的热心帮助。感谢赵鑫鑫、方晗、张瑜、杨梦茜同学在实验过程中给予的帮助和鼓励。感谢你们在我难过的时候给予我的安慰。最后感谢我的父母和朋友，是他们在我懈怠时激励我继续前进，在我失落的时候给我勇气。感谢每一位在我毕业论文期间给予我帮助的人。参考文献[1] 仉文升, 李安良. 《药物化学(三)》[M].高等教育出版社.1999,191-195. 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目录
新型四环素失活酶机制研究 3
1 实验材料 4
1.1实验材料 4
1.2试剂与仪器 4
2 实验步骤与方法 6
2.1 四环素钝化酶基因引物的设计 6
2.2 目的基因的扩增 6
2.3 目的基因的酶切 7
2.4 表达载体 pET30a(+)的酶切 7
2.5 连接反应 8
2.6 转化 9
2.7 感受态细胞 E.coli BL21 的制备 9
2.8钝化酶的异源表达 10
2.9钝化酶的纯化 11
2.10钝化酶的鉴定 11
3 实验结果与分析 13
3.1 目的基因的扩增 13
3.2 目的基因的酶切 13
3.3 表达载体 pET30a(+)的酶切 14
3.4 转化 14
3.5 四环素钝化酶的诱导表达与纯化 15
3.6 SDSPAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 15
4讨论 16
参考文献： 17
新型四环素失活酶机制研究
引言
原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/spzlyaq/563847.html
