基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是一种广泛应用于食品与医疗领域，对相关病原菌进行鉴定分析的检测工具已建立在食品与医疗相关病原菌鉴定领域的检测工具，应用该技术能够对食源性致病菌的属、种水平做到快速鉴定与溯源分析。但目前商业数据库谱图在食源性致病菌领域代表性不足，相关条目仍需扩充，且在致病菌样品制备上以化学提取法为主，步骤繁琐，。本研究对实验样品培养，点样方式和基质选择方面 进行优化，以全细胞为目标对大肠杆菌，弗氏志贺氏菌，铜绿假单胞杆菌，单增李斯特菌, 肠炎沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌6六种病原菌进行质谱分析，通过数理统计原理，利用主成分分析法对所获取的质谱图进行鉴定与同源性分析，采用20株李斯特菌进行验证，建立一种快速的食源性致病菌指纹图谱检测方法。因而有必要以优化的MALDI-TOF实验条件和全细胞提取分析为基础，建立一种通用的MALDI-TOF-MS检测方法。该方法通过数理统计原理，利用主成分分析法对所获取的质谱图进行鉴定与同源性分析，建立规范的食源性致病菌特异性蛋白质指纹图谱库。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言（或绪论）2
1材料与方法3
1.1材料与试剂 3
1.1.1菌株 3
1.1.2试剂3
1.2仪器与设备3
1.3优化实验方案3
1.3.1菌株培养3
1.3.2样品前处理4
1.3.3基质选择4
1.3.4点样方式4
1.3.5质谱条件4
1.4质谱峰采集与最优因素确立5
1.4．1数据采集5
1.4．2结果判断5
1.4．3数据分析5
2结果与分析5
2.1 MALDITOFMS优化实验鉴定结果与分析7
2.2 MALDITOFMS标准菌株验证实验结果分析6
2.3 MALDITOFMS单增李斯特菌株模型实验结果分析7
3讨论9
致谢10
参考文献10
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S检测方法构建
引言
引言
食品安全已经成为影响人类和社会生存与发展的重要问题之一，随着人们生活质量的普遍提高，这一问题越来越受到关注。近年来，食品安全问题不断爆发，给人们带来了巨大的危机感，引起了全世界的广泛关注。在许多影响食品安全的潜在污染物中，食源性致病微生物是最重要的因素之一。一旦食源性病原体污染食物，它们将在短时间内繁殖并产生对人体健康有害的代谢物，导致食物中毒、腹泻甚至死亡等不良反应[1]。
病原菌的常规检测和鉴定主要依据细菌的形态、生化反应、抗原、遗传等特征。此外，微生物可以与形态学观察、分离培养、生化实验、血清学实验、噬菌体实验等测试方法相结合[2]。虽然上述实验具有较高的准确度和灵敏度，但实验内容多，操作复杂。最终的结果通常需要几天的时间和巨大的工作量。鉴于食源性致病菌繁殖速度快，对人体危害大，有必要建立一种快速、简便、准确的食源性致病菌检测方法。现代流行的微生物鉴定技术包括荧光免疫学、分子生物学和代谢技术[3]。这些技术主要基于微生物的形态、生态和生化特性。存在操作繁琐、重复性差、周期长等问题。此外，它们在微生物分型和鉴定方面的准确性和稳定性较差[4]，这使得它们很难应用于进化、分类和遗传研究。质谱法是利用带电离子的电荷质量比来鉴别探测器的技术。长期以来，传统的质谱离子源的由于激光束能量过高，容易导致被测物质：生物大分子等的分解，因此更适合于检测小化学小分子的检测。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDITOFMS)是一种基于蛋白质组学的软电离生物质谱，其通过检测微生物蛋白质，绘制特异性谱图达到鉴定微生物的目的[56]。微生物蛋白质主要受遗传物质控制，具有显著的特异性，不同血清型的微生物在部分特异性蛋白质上具有较明显差异[7]。MALDITOFMS利用基质解吸电离方式采集微生物蛋白质组的质谱数据，并对谱图中的蛋白质标识峰数据与数据库中数据进行多重比较[8]，从而达到对微生物进行鉴定的目的。目前，国内外已经将MALDITOFMS已被方法广泛应用在于食源性致病菌的快速检测鉴定中。MALDITOFMS技术作为一项全新技术，在食品微生物检测领域拥有巨大潜力，在食品微生物的鉴定与分型领域被广泛采用。其主要的鉴定依据有以下四点：（1）不同微生物的指纹图谱具有普遍差异；（2）特征性模式峰能应用于细菌分型以及种、属鉴定；（3） 实际样品可以通过商业标准菌种数据库进行分析比对，依照得分分值与自动化鉴定结果进行结果对照；（4）利用Biotyper全自动分析软件可以对大部分微生物质谱进行全自动化分析。然而，由于国内对该技术的研究和应用处于探索阶段，在商业领域虽已建立一个较完整的菌株谱图数据库，但只包含在食品与医疗领域有重大相关性的菌株数据，并未建立一个一般标准、容纳绝大多数已知细菌质量指纹图谱数据库，而国外正在积极建设扩大标准数据库[9]，但是数据库中的数据绝大多数均源于国外，不同国家和地区的同种菌株可能存在一定的地理差异，大部分标准数据并不适用于我国国内相关菌株鉴定[10]。此外，利用MALDITOFMS质谱分析仅限于部分细菌。尽管有各研究者已经建立了多种实验方法用于MALDITOFMS鉴定细菌，可是已报道的方法都不具有通用性，该方法只适用于一定范围内的细菌，不能提供足够的数据用于分析更多特性的菌种分析，且大部分实验均采用化学提取法来提取菌体蛋白， 极少采用全细胞提取法[1113]。因此，需要建立适合我国各种细菌而不是某一特定种类细菌检测和鉴定的谱图数据库，并不断增加数据库的菌株种类和数量，才能保证MALDITOFMS技术检测鉴定的准确性。因此，鉴于目前国内谱图数据库条目的不足，以及未有统一且完整的实验方法，本研究基于MALDITOFMS快速、准确、高通量、易于标准化等特点，以全细胞为目标提取作为获细菌的质谱图，结合主成分分析，建立食品中常见6种致病菌的快速检测方法快速检测的目的，并在标准菌，以及熟肉获取的单增李斯特菌为目标菌，验证该方法的实际应用性能。待测菌的检测鉴别中的应用进行探索，以建立适用于一般的，全细胞提取为基础的，能够更加快速，简单的对待测食源性致病菌进行检测。

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