1关键词 1ABSTRACT 1KEY WORDS 21引言 22 实验材料和方法 32.1实验材料 32.1.1 菌种 32.1.2 培养基 32.1.3 仪器 32.1.4 试剂 42.2 实验方法 42.2.1 提取基因 42.2.2 PCR扩增 52.2.3 胶回收 52.2.4 T载连接 62.2.5 感受态细胞制备 62.2.6 质粒转化 62.2.7 菌落PCR 72.2.8质粒提取 72.2.9 构建表达载体 72.2.10 荧光测定 83 实验结果与讨论 83.1 初始费氏弧菌QS系统的构建 83.1.1 费氏弧菌QS系统相关基因的克隆及其表达载体的构建 83.1.2 费氏弧菌QS系统启动子的克隆及其表达元件的构建 83.1.3 初始费氏弧菌QS系统在工程菌内的组装 93.2 费氏弧菌QS系统异源重构限制因素的探索 93.2.1 T7启动的信号分子蛋白基因的克隆及其表达载体的构建 93.2.2 T7启动的受体蛋白基因的克隆及其表达载体的构建 103.2.3 改良后费氏弧菌QS系统在工程菌内的组装 103.3不同碳源对费氏弧菌群体感应系统活性的影响 113.4 讨论与展望 13致谢 14参考文献 15一种来源于费氏弧菌的群体感应系统的异源重构微生物的群体感应(Quorum sensing，QS)系统可以感受范围内细菌密度并自发调节基因表达。费氏弧菌作为最早被发现存在QS系统的微生物，对其QS系统研究已经十分透彻，但是尚未在工程菌内成功重构一套有活性的费氏弧菌QS系统，对其异源重构的限制性因子研究也尚不清晰。费氏弧菌QS系统存在三大基本元件，启动子pluxI、信号分子LuxI、受体蛋白LuxR。本文将费氏弧菌QS系统构建至工程菌内，首先用自身启动子pluxI启动受体蛋白基因和信号分子蛋白基因，系统没有活性。推测是因为自带启动子太弱，导致信号分子、受体蛋白浓度过低，所以QS系统无法正常运行。对信号分子蛋白基因和受体蛋白基因启动子进行更换，用T7启动子替换自身启动子，在工程菌内进行重组，发现更换T7启动子后QS系统活性变强，证实了信号分子和受体蛋白浓度是费氏弧菌QS系统异源重构的限制因子。最终通过在大肠杆菌内成功构建一套依赖IPTG诱导的具有活性的QS系统，并对其在不同碳源发酵下的活性进行了比较，为构建能够实现自主调控的基因开关打下了基础。
目 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
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引言
1引言
微生物的群体感应(Quorum sensing，QS)是一种微生物之间通过可以扩散的信号分子进行交流，当环境内信号分子达到一定浓度后产生自发调节相关基因的表达的现象，QS系统使微生物保持良好的生长状态。
人类最早从海洋弧菌费氏弧菌中发现存在QS现象，其QS系统已经研究的非常透彻[1]；费氏弧菌通过QS调节生物发光，借助这一特性和许多真核宿主建立共生关系[2]。费氏弧菌中的LuxI/R群体感应系统由luxicdabe、luxr两个操纵子组成。luxi负责编码LuxI信号分子蛋白，参与信号分子N(3氧己酰)高丝氨酸内酯的合成，正常情况下保持较低的表达量。luxr负责编码LuxR受体蛋白，受体蛋白和信号分子结合后构象发生变化，可以和luxr和luxi基因中间的启动子区序列结合，启动下游基因的表达。luxab操纵子负责编码荧光素酶亚基。在胞内荧光素酶催化下，分子氧将还原态的黄素单核苷酸及长链脂肪醛氧化为长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为450490 nm处的蓝绿光。在海水中时，费氏弧菌的浓度较低，其周围的信号分子浓度也较低，因此合成荧光素酶的lux基因关闭，细菌不发光。当费氏弧菌附着于鱼类或乌贼等海洋生物上时，菌体密度达到一定的程度，lux基因被强力启动，细菌发出荧光。
目前QS系统研究的主要方向是针对有害微生物的检测与防治。在医疗领域，研究利用致病菌自身的QS启动子感应致病菌的QS信号分子，启动工程菌内部人为构建的定向杀菌元件查找并杀死致病菌[35]，实现了对致病菌的追踪查杀。微生物污染是导致食品腐败的重要原因之一，且致腐作用与QS系统密切相关，在抑制食品腐败菌方面，有利用天然提取或者人工合成的群体感应抑制剂，通过抑制信号分子的生成、抑制信号分子和受体蛋白的结合或者加速信号分子的降解等多种手段截断腐败微生物之间的交流，从而阻止由QS调控的腐败相关基因的表达，抑制食品中特定腐败微生物引起的食品腐败[69]，这在提高食品质量、保障食品安全方向提供了新的思路[10]。
虽然费氏弧菌是最早被发现存在QS系统的微生物，并且对其QS系统研究已经十分透彻，但是尚未在工程菌内成功重构一套有活性的费氏弧菌QS系统，对其异源重构的限制性因子研究也尚不清晰。本文从费氏弧菌基因组上克隆出QS系统三大基本元件，信号分子luxI、受体蛋白luxR、启动子pluxI。将它们构建至大肠杆菌BL21（DE3）中，以绿色荧光蛋白作为报告信号进行定性分析。通过荧光显微镜观察进行定性分析来验证QS系统是否有活性；通过荧光酶标仪检测相对荧光强度确定QS系统的活力强弱。
本文之所以选用大肠杆菌作为表达菌株，是因为大肠杆菌作为一种模式微生物，能够模拟其他微生物的代谢过程，异源表达来自不同物种的基因，是研究微生物转化并应用于实际生产的重要菌株[11]。另外，大肠杆菌是人们克隆表达外源基因的主要菌株，因为其有大量可供选择的克隆载体与表达载体，同时其基因组已被完全测序。并且工程菌BL21（DE3）内存在T7RNA聚合酶。综上所述，大肠杆菌是最适合构建QS系统的表达菌株[12]。
实验中发现更换T7启动子后能够高效启动基因的转录表达，使得信号分子和受体蛋白的表达量大大提高，使费氏弧菌QS系统正常运行，证明了信号分子和受体蛋白浓度是费氏弧菌QS系统异源重构的限制因子。考虑到在发酵过程中可能会添加不同碳源，所以实验中设计了以葡萄糖、甘油、不加碳源的条件分别进行发酵，验证了在不同碳源条件下发酵对QS系统活性的影响。
最终本文通过在大肠杆菌中成功构建一套依赖IPTG诱导的有活性的群体感应系统，并对其在不同碳源发酵下的活性进行了比较，为构建不需诱导剂诱导、能够自主调控的基因开关打下了基础。
2 实验材料和方法
2.1实验材料
2.1.1 菌种
大肠杆菌(Escherichia coli JM109)用于质粒的复制，大肠杆菌((Escherichia coli BL21(DE3) )用于途径的表达及菌株发酵。
2.1.2 培养基
LB(Luria broth)液体培养基：10 g胰蛋白胨(Tryptone)，5 g酵母提取物(Yeast extract)，10 g NaCl,用1 mL 1 mol/L NaOH调节PH至7.4，用去离子水定容至1 L，121℃高压下蒸汽灭菌20 min。
LB固体培养基：10 g胰蛋白胨(Tryptone)，5 g酵母提取物(Yeast extract)，10 g NaCl，20 g琼脂粉，用1 mL 1 mol/L NaOH调节PH至7.4，用去离子水定容至1 L，121℃高压下蒸汽灭菌20 min。
2.1.3 仪器
表1 实验仪器
序号
仪器
制造商
1
STG全塑通风吸毒柜
南京环保防腐通风设备厂
2
立压压力蒸汽灭菌器
上海申安医疗器械厂
3
紫外分光光度计
上海菁华科技仪器有限公司
4
台式高速离心机
Eppendorf艾本德中国有限公司

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