灵芝线粒体细胞色素c氧化酶亚基的表达纯化【字数：9382】
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1 材料与方法5
1.1 灵芝线粒体细胞色素c氧化酶亚基基因Gl17918与Gl26658片段的获取 5
1.1.1 RNA的提取 5
1.1.2反转录5
1.1.3 目标片段的PCR扩增5
1.1.4 连接T载体6
1.1.5 感受态细胞的转化6
1.1.6 菌落PCR鉴定与测序6
1.2 大肠杆菌表达载体的构建6
1.2.1 质粒的提取 6
1.2.2 T Gl17918、T Gl26658、pCOLD空载质粒和pET28a空载质粒的酶切 7
1.2.3 目标片段与空载表达载体的酶连 7
1.2.4 感受态细胞的转化 7
1.2.5 菌落PCR鉴定与测序 7
1.2.5 感受态细胞的转化 7
1.3 灵芝线粒体细胞色素c氧化酶亚基基因Gl17918与Gl26658片段的体外诱导表达 7
1.3.1 提取质粒 8
1.3.2 表达菌株转化 8
1.3. *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ￥351916072￥
3 诱导表达 9
1.3.4 SDSPAGE电泳分析 9
1.4 目标蛋白的纯化 9
1.4.1 蛋白上清液的纯化 9
1.4.2 包涵体的纯化 9
2 结果与分析 9
2.1灵芝线粒体复合物Ⅳ相关基因克隆 9
2.2 pET28aGl17918、pET28a Gl26658、pCOLDGl17918、pCOLD Gl26658表达载体的构建 10
2.2.1 pET28a空载质粒、pCOLD空载质粒、T Gl17918、T Gl26658的双酶切 10
2.2.2 酶连与感受态转化 10
2.3 目标蛋白的表达11
2.3.1 将重组质粒转化到大肠杆菌BL21和Rosetta表达菌株并PCR鉴定11
2.3.2 体外目标蛋白诱导表达11
2.4 目标蛋白的纯化13
2.4.1 RosettapCOLDGl26658表达产物上清的纯化13
2.4.2 RosettapCOLDGl26658表达产物包涵体的纯化 13
3 讨论14
致谢15
参考文献16
附录一：目标基因序列16
灵芝线粒体细胞色素c氧化酶亚基的表达纯化 国家生命科学与技术人才培养基地学生 朱逸凡
引言
引言
随着体外DNA重组技术和蛋白质分析技术的迅猛发展，外源蛋白表达技术成为了现代最重要的生物技术之一。自20世纪70年代基因工程技术诞生至今[1]，基因工程技术已经成为近代生物技术中必不可少的一部分。基因工程技术以分子生物学、分子遗传学、生物化学等学科为基础，在体外构建目标DNA分子，以改变生物体原有的遗传特性以及性状。外源蛋白表达技术通过构建表达载体，将目的基因载入受体细胞进行表达，获得目标蛋白，使基因工程技术构建的重组DNA分子得以在体外得到表达和研究。同时，目标蛋白的分离纯化技术为体外蛋白研究奠定了坚实的基础，随着蛋白分离纯化技术的发展，纯化效率和质量不断提高，为体外蛋白研究减少了障碍。
目前，蛋白表达系统主要有原核表达系统、真核表达系统和杆状病毒表达系统等。[2]本课题采用原核表达系统的大肠杆菌表达系统进行实验，并选用pET28a和pCOLD作为表达载体。大肠杆菌表达系统相较于其他载体，能够更高效、高产量、高成功率地表达外源基因，是目前应用最为广泛的表达载体。大肠杆菌作为一种原核生物，结构较为简单，培养技术难度低、表达水平高、生长速度快。同时生产成本较低，适用范围非常广泛，是非常理想的表达系统。在外源蛋白表达时，为保证DNA复制的稳定和蛋白的成功表达，常选用特殊的突变型菌株作为表达宿主。常用的表达宿主包括DH5a菌株、BL21(DE3)菌株、Rosetta(DE3)菌株等。DH5a菌株含有的recA1突变和endA1突变，有利于DNA的稳定复制，因此常用于质粒克隆及蓝白斑筛选。BL21(DE3)菌株是BL21系列菌株中研究最成熟的菌株之一，是典型的蛋白酶缺陷型菌株。蛋白酶缺陷型菌株可防止菌株产生过多的蛋白酶，降解表达的蛋白，影响蛋白表达的成功率以及效率，因此通常选用蛋白酶缺陷型菌株作为蛋白表达宿主。Rosetta(DE3)菌株来源于BL21系列菌株宿主谱，在BL21系列菌株的基础上增加了真核细胞密码子，真核细胞的蛋白表达水平得到了很大程度的提升。
图1 pET28a表达载体和pCOLD表达载体图谱
蛋白纯化是体外蛋白研究必不可少的一项技术。目前对蛋白纯化的原理主要是利用其物理化学性质的特殊差异，如溶解度、分子大小、带电性质等对其进行分离与纯化。根据需纯化蛋白的特性可以选择不同的纯化方法，以提高纯化蛋白的质量。[3]
原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/606392.html
