目录
摘要 II
关键词 II
ABSTRACT III
KEY WORDS III
引言 1
1 材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1 菌株及质粒 3
1.1.2 培养基及溶液配方 3
1.1.3 主要酶及试剂 3
1.1.4 主要仪器 3
1.2 实验方法 4
1.2.1 粘质沙雷氏菌FS14中目的基因表达质粒的构建 4
1.2.2 蛋白的表达与纯化 7
2 结果与分析 9
2.1 质粒构建结果 9
2.1.1 PCR扩增结果 9
2.1.2 酶切结果 9
2.1.3 质粒鉴定结果 10
2.1.4 酶切验证结果 10
2.2 大肠杆菌C43重组质粒蛋白的表达与纯化结果 11
2.2.1 诱导表达结果 11
2.2.2 蛋白的小量纯化 12
3 讨论 13
3.1 重组质粒的构建 13
3.2 组氨酸激酶PmrB 13
3.3 应用前景 14
致谢 15
参考文献 16
附录 18
沙雷氏菌FS14中组氨酸激酶01990全长及其
膜外部分的表达纯化
摘 要
双组分系统是一类信号转导系统，其广泛存在于原核细胞中。双组分系统主要由组氨酸激酶 (histidine kinase) 和响应调控蛋白 (response regulator)组成，通过双组分蛋白的磷酸化和去磷酸化来调节细胞信号传导途径。组氨酸激酶的传感器结构域可以在体内外检测到刺激信号，从而调控组胺酸激酶的活性。组氨酸激酶能催化特定的ATP依赖性组氨酸残基的自主磷酸化，然后反应调控蛋白催化组氨酸的磷酸基团转移到它自身的天冬氨酸残基上，反应调控蛋白的磷酸化激活效应器结构域，从而产生一系列调控反应。本课题以粘质沙雷氏菌FS14(Serratia marcescens FS14）的基因组DNA为模板，利用PCR技术扩增出组氨 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072^ 
酸激酶01990全长及其胞外部分基因，分别将其克隆到pColdxmx2和pET28aMBP表达载体中，将重组质粒转化到大肠杆菌C43(DE3)中进行蛋白质的异源诱导表达。经过NiNTA亲和层析获得了较纯的目的蛋白，据聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）结果显示，含01990全长基因的重组质粒菌株经诱导后表达出约40kDa的蛋白，含01990胞外部分基因的重组质粒菌株表达出约46kDa的蛋白。
引言
沙雷氏菌（Serratia sp.）又称灵杆菌，是一种在食物、水和土壤等环境中广泛存在的兼性厌氧菌，能产生紫色、黄色和红色非水溶性色素的革兰氏阴性菌。在生物体中，沙雷氏菌一般存在于动物的肠道或呼吸道中，或在植物的茎、叶等器官上[1]。粘质沙雷氏菌能合成灵菌红素，灵菌红素具有多种生物学活性，如抗菌，抗霉，免疫抑制等[2]。沙雷氏菌在过去二十年被认为是医院获得性感染的原因之一[3]，某些沙雷氏菌菌株是条件性病原体[4]，被认为是所有可能感染的病因，包括呼吸道感染、尿路感染(UTI)、败血症、脑膜炎和伤口感染[57]，其中90%以上引起尿路感染的菌是多重耐药的[8]。
为了应对不同环境的变化，细菌已经进化出很多种细胞信号转导途径，其中磷酸化和去磷酸化是生物体中最为普遍的途径之一，该过程被不同激酶催化完成。磷酸化介导的信号转导机制是绝大多数细胞都会用来响应代谢、环境以及细胞周期等变化的一种途径。其中，真核细胞主要利用丝氨酸、苏氨酸激酶或酪氨酸激酶来催化磷酸化反应，而原核细胞通常采用组氨酸和天冬氨酸磷酸化的信号系统，即“双组分信号系统”(two component system，TCS) [9] 。双组分系统广泛存在于原核细胞中，由组氨酸激酶(histidine kinase)和反应调控蛋白(response regulator)组成，通过双组分蛋白的磷酸化和去磷酸化来调节细胞信号传导途径。
组氨酸激酶是细菌感知各种环境变化所必需的，它通常是由两个单体组成的同源二聚体膜蛋白。而其单体是由一个可变的传感器结构域(sensor domain) 通过跨膜的α螺旋和一个保守的传递器结构域(transmitter domain)连接构成的。传感器结构域可以感知环境的变化，并将信号传递到细胞质传递器催化结构域。反应调控蛋白含有一个或多个保守的N端接受器结构域（又称输入结构域)和可变的 C 端效应器结构域（又称输出结构域）。在双组分系统的信号转导途径中，组胺酸激酶负责检测和编码输入信息，反应调控蛋白控制输出信息 [10]。
双组分系统的信号转导与大多信号途径相似，组氨酸激酶的传感器结构域能够检测到体内外刺激，调控组氨酸激酶的活性。组氨酸激酶催化ATP依赖的特定的组氨酸自主磷酸化，然后反应调控蛋白催化组氨酸的磷酸基团转移到它自身的天门冬氨酸残基上，反应调控蛋白的磷酸化激活效应器结构域，从而产生一系列调控反应[10]。
当外界或内部环境变化时，组氨酸激酶的传感器结构域可以感应到环境的刺激并迅速二聚化，催化特定的ATP依赖性组氨酸的自主磷酸化，然后将组氨酸上的磷酸基团转移至反应调控蛋白的天冬氨酸残基上，反应调控蛋白磷酸化后可激活效应器结构域，从而与下游基因的启动子或蛋白相互作用，产生调控应答反应[11,12]。组氨酸激酶和反应调控蛋白形成了对刺激信号作出感应并产生应答一个双组分系统的核心。组氨酸激酶活性在应对信号分子刺激时被激活，从而产生感应信号[13]。反应调控蛋白负责系统信号的输出，它常作为转录因子来结合DNA发挥作用[14]。这两种蛋白质之间的磷酸基团转移反应需要在组氨酸激酶的磷酸化结构域和反应调控蛋白的磷酸输入结构域之间形成精确的瞬时复合物[10]。

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/606390.html