二酰甘油（diacylglycerol,DAG）控制着广泛的细胞功能。因此，要了解DAG如何调节细胞功能，就必须找出DAG浓度在活细胞中在何处、何时以及在何种程度上增加和/或减少。带着这个目的，我们利用荧光成像技术构建了几种DAG生物探针来可视化DAG在活细胞中的时空动态。我们将这几种DAG探针在烟草和拟南芥中进行表达，结果显示，PM-DAGleon探针在烟草中表达较为强烈，且主要定位于质膜；其突变探针PM-mDAGleon的表达与其相似。我们将PM-DAGleon载体的质膜定位序列K-Ras4B-CT置换成核定位序列WPP+SUN1并将获得的新探针Nu-DAGleon在烟草中进行瞬时表达。其激光共聚焦观察结果显示，Nu-DAGleon能在细胞核内很好的表达，部分探针蛋白在细胞膜和胞质中也有所表达。此外，为了让探针在我们预期的细胞层部位表达，我们将PM-DAGleon探针上的Super强启动子替换为PIN1、PIN2和PIN4基因的启动子，构成了三种PINs启动子的新的DAG Sensor，并且成功在烟草中表达。最后，我们利用已获得的DAG生物探针检测了铵盐处理下DAG在拟南芥根尖细胞内的动态变化。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
实验材料 4
1.1.1 植物材料的培养4
1.1.2 菌株与载体4
1.1.3 培养基的配置5
1.1.4 酶和其他试剂5
1.2 实验方法 6
1.2.1构建载体6
1.2.2 GST蛋白的表达8
1.2.3 GST标签蛋白的纯化9
1.2.4 SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDSPAGE）电泳9
1.2.5 转膜10
1.2.6 Western blotting检测10
1.2.7蛋白与脂结合实验10
2 结果与分析10
2.1 DAG探针在拟南芥中的表达10
2.2 DAG探针在烟草中表达11
2.3 PIN启动子下的DAG探针12
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DAG对铵毒害的响应12
3 讨论 13
3.1 DAG探针的制备13
3.2 DAG探针的表达13
3.3 DAG生物探针的应用13
致谢13
参考文献14
植物磷脂DAG探针的开发和应用
引言
引言
DAG是由一个甘油分子的三个羟基中的两个羟基和两个脂肪酸缩合失去两分子水形成的酯，是激素信息传递的磷酸肌醇系统中具有第二信使作用的化学信息分子。当激素、神经递质与膜受体结合后，激活G蛋白介导的磷酯酶C（phospholipaseC,PKC），从而催化磷脂酰肌醇4，5二磷酸（phosphatidylinosital biphosphate,PIP2）水解产生肌醇三磷酸（inositol triphosphate,IP3）和DAG，IP3进入胞浆，DAG留在膜内[1]。DAG招募信号蛋白，如蛋白激酶C异构体、Ras鸟嘌呤核苷酸释放蛋白和嵌合蛋白，从而在DAG产生的膜区激活它们[2,3]。通过信号蛋白的空间调节激活，DAG控制着广泛的细胞功能，例如调节从高尔基体到质膜的囊泡运输和细胞增殖[4,5,6]。Sato等人基于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）开发了DAG基因编码荧光指示剂。在指示剂上，通过由重复的EAAAR序列组成的刚性α螺旋接头融合了蛋白激酶Cβ上定位在青色和黄色荧光蛋白之间的富含半胱氨酸的结构域（cysteinerich domain,CRD）是一个特定的DAG结合域[7]。当细胞膜上产生的DAG与CRD结合后，会导致指示剂构象发生变化。这种触发器式的构象变化导致从CFP到YFP的FRET增加，并允许通过双发射比成像稳定观察DAG。因此，将这个指示剂系在质膜或细胞器膜上，通过将其与特定的膜定位序列（membrane localization sequences,MLSs）融合，就可以对DAG进行局部分析[8]。
基于对以上方法的了解，我们切除了实验室已有的PA探针[9]上标记PA的区域，连接上DAG的特异结合区域PKCβ1，成功构建了三种DAG生物探针，并在拟南芥和烟草中成功表达。
铵是植物的主要无机氮源，是根系吸收的主要无机氮形式之一[10]。在较低的外部供应时，铵促进植物生长，而在较高的外部供应时，铵引起毒性。大多数物种的根更喜欢吸收铵而不是硝酸盐[11]，铵的毒性会抑制根和茎的生长。根细胞对铵暴露的直接生理反应是质膜的短暂去极化[12]。DAG在植物生长发育以及抗逆过程中都起到了重要作用，为了探究铵盐胁迫下，DAG在植物体内的动态变化，我们用铵盐处理了拟南芥植株并用已获得的DAG探针对其根部进行了检测。
1 材料与方法
1．1 实验材料
我们采用拟南芥和烟草作为本次的植物材料。
烟草品种：本氏烟草 (Nicotiana benthamiana)由本实验室保存提供。
拟南芥品种：本实验所使用的拟南芥材料为哥伦比亚生态型Columbia（Col0）背景。
35S启动子的DAG探针遗传材料由荷兰阿姆斯特丹大学的Teun Munnik教授馈赠。
1．1．1 植物材料的培养
烟草培养：首先将蛭石和营养土（3：1）混合在花盆中，撒上烟草种子，等烟草长出后把多余的小烟草拔掉，确保每花盆中只有一颗烟草。然后在25 ℃，16 h 光照/8 h黑暗条件下在培养室培养约四周使用。
拟南芥培养：先将种子放入70%（v/v）的乙醇中浸泡5 min进行消毒，然后用2%（v/v）的次氯酸钠溶液消毒6 min，最后用无菌水清洗45次；把消毒后的种子用移液枪均匀的种在灭过菌的1/2 MS固体培养基上（100 ml体系1/2 MS培养基配方为：1%蔗糖，1.5%琼脂粉，0.22 g MS盐，调pH至5.7；121 ℃高温灭菌20 min，待温度合适后倒在9 cm无菌玻璃培养皿上）；随后放到4℃冰箱春化1224 h，然后将培养皿垂直放置在160 μmol photons m2s1光照强度、光周期为14/10 h（23 ℃/21 ℃）（白天/夜晚）、60%相对湿度的生长室内生长。

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