磷脂酶C（phospholipase C, PLC）是一类重要的磷脂水解酶，根据其水解底物的特异性，可以分为非特异性磷脂酶C（non-specific PLC, NPC）和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（phosphoinositide-specific PLC, PI-PLC）。NPC可以水解磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholine，PC）等脂类，产生二酰基甘油（diacylglycerol，DAG）和一个磷酸基团。NPC蛋白可以参与调控植物细胞生长发育和应答环境胁迫，其中，NPC3/4蛋白可以参与生长素信号传递过程。为了探究这一过程具体的分子机制，本实验通过用50mM NH4+处理npc1-6突变体和野生型拟南芥，发现npc3和npc4主根长度显著变短，NPC1-6基因表达情况都有不同程度的下降；用生长素（IAA）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）、细胞分裂素（CTK）和甘露醇处理野生型拟南芥，结果发现这些激素均诱导NPC1-6基因表达，之后，用启动子-GUS转基因材料证明了生长素可以诱导NPC3/4/5基因表达。为了进一步研究NPC是如何参与生长素调控，在拟南芥官网TAIR网站 BioGRID中预测NPC3与生长素输出载体蛋白PIN4存在互作，同时运用了免疫共沉淀（CoIP）进行了验证。综上所述，本实验初步证明了NPC3/4可以通过调节PIN4的转运活性，调控植物根部生长素分布，来应答高铵等胁迫。
目录
摘要3
关键字3
引言4
1 材料与方法5
1.1 实验材料5
1.1.1 植物材料、菌株及载体5
1.1.2 培养基的配置5
1.2 实验方法5
1.2.1 TDNA插入突变体材料的鉴定5
1.2.2 拟南芥总RNA的提取5
1.2.3 植物总RNA的反转录6
1.2.4 基因克隆和载体构建7
1.2.4.1 引物设计7
1.2.4.2 目的片段的扩增7
1.2.4.3 目的片段的回收、酶切与连接7
1.2.4.4 大肠杆菌转化（热激法）8
1.2.4.5 菌落PCR鉴定阳性克隆8
1.2.4.6 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: &351916072& 
质粒的提取和验证8
1.2.5 RTPCR和qRTPCR8
1.2.6 GUS染色9
1.2.7 农杆菌转化（电击法）9
1.2.8 烟草侵染9
1.2.9 高铵胁迫下npc突变体表型和NPC基因表达的观察10
1.2.9.1 高铵处理对npc突变体的影响10
1.2.9.2 高铵处理对NPC基因表达的影响10
1.2.10 不同激素和胁迫处理下NPC基因表达的观察比较10
1.2.11 GUS染色法观察比较不同激素和胁迫处理下NPC的表达10
1.2.12 真核蛋白提取10
1.2.13 CoIP检测蛋白互作11
2. 实验结果与分析11
2.1 突变体材料的鉴定11
2.2 高铵胁迫对npc变体表型及NPC基因表达的影响12
2.2.1 高铵处理对npc突变体主根的影响12
2.2.2 高铵处理对NPC基因表达的影响13
2.3 同胁迫和激素处理对NPC基因表达的影响13
2.4 GUS染色法分析不同激素和胁迫对NPC表达的影响14
2.5 CoIP体内验证NPCs与PIN4的互作14
3. 讨论15
3.1 NPC响应高铵胁迫和生长素信号传导15
3.2 NPC3/4/5与PIN4之间有互作关系15
致谢16
参考文献16
拟南芥NPC调控铵毒机理的初步研究
引言
磷脂是细胞膜的主要成分，细胞膜是细胞和外界沟通的界面，磷脂可以作为信号脂质，在细胞感受、应答胞外刺激和胁迫中起重要作用[12]。为了应对外界复杂的环境变化，生物必须要建立起高效有序的信号传递通路，其中，磷脂的水解反应在植物的生物与非生物胁迫中广泛存在[3]。磷脂酶 (phospholipases) 是催化磷脂水解的一种酶，根据甘油磷脂被水解的不同部位，可以将其分为4大类：磷脂酶A1 (phospholipase A1, PLA1)、磷脂酶A2 (phospholipase A2,PLA2)、磷脂酶C (phospholipase C,PLC)和磷脂酶D(phospholipase D,PLD)[4]。其中，PLC所介导的细胞信号传递是最典型的信号通路之一[5]。PLC又可以分为磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PIPLC，磷脂酰肌醇作为底物)和非特异性磷脂酶C(Nonspecific phospholipase C，NPC)，它们两者的水解底物专一性不同。其中：PIPLC特异性水解磷脂酰肌醇4，5二磷酸（phosphatidylinosital biphosphate,PIP2），水解产生肌醇三磷酸（inositol triphosphate,IP3）和二酰甘油（DAG），而NPC可以水解不同的磷脂，例如：磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine，PC)和溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid，lysoPA）等磷脂，产生一个磷酸基团和DAG。
迄今为止，人们发表了许多有关于PIPLC的论文，对PIPLC的结构特征、蛋白功能和信号转导等研究的较为清楚。但对NPCs是如何响应外界刺激并调控细胞应答，它的分子细胞机制却所知较少。有研究表明，NPC在植物和细菌之间存在三个高度保守的结构域[6]，但这些结构域与任何已知的序列均不对应，因此，NPC与其他磷脂酶存在结构和功能的不同，它所调控的信号传导过程也与PIPLC的截然不同。
拟南芥基因组中有6个编码NPC蛋白的基因，其被命名为NPC16。这些基因编码蛋白质的分子质量约为60kD，由514～538个氨基酸残基组成，组成的氨基酸序列之间相似度较高，存在功能性冗余[7]。在组织表达水平上，拟南芥NPC1在各组织中均有较高的表达，NPC2和NPC6在荚果的表达量高，NPC5在花器官的表达量较高，NPC3和NPC4在根尖强烈表达[8]。其中，在亚细胞地位中，NPC3和NPC4位于细胞质膜，而且，NPC蛋白在调控植物应对盐害、干旱和根发育等生命活动有重要作用，已有研究表明，NPC4参与调控盐胁迫和ABA信号传递途径[8]。拟南芥npc4突变体在种子萌发、根发育和气孔运动对ABA表现不敏感，而且对盐胁迫表现敏感。
生物的生命活动离不开氮元素，植物也是如此。植物最主要的无机氮源是铵，植物不仅可以通过根部从外界获取铵，而且还可以通过内源性代谢生成，如硝酸盐还原、氨基酸分解代谢等[9]。铵在较低的外部供应下，会促进植物的生长，但在较高外部供应下，会引起毒性。铵离子浓度较高的情况下，植物体内氮的运输和回收过程会被逆转，铵作为氮源被吸收的有益性就会变得有害，这被称为铵盐毒害。铵的毒性通常表现在会抑制根和芽的生长，这与离子失衡，叶绿化，跨膜pH梯度紊乱有关[10]。

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