目录
摘要3
关键词3
Abstract4
Key words4
引言5
1材料与方法7
1.1实验材料 7
1.1.1菌株7
1.1.2药品及试剂8
1.2实验方法 8
1.2.1转座子随机插入法构建突变株文库8
1.2.2生长曲线测定10
1.2.3对不同胆盐成分耐受能力测定10
1.2.4杀菌实验11
1.2.5生物膜检测11
2结果与分析11
2.1胆盐敏感株的筛选11
2.2转座子插入失活基因的确定11
2.3生长曲线检测12
2.4对不同胆盐成分耐受能力测定12
2.5杀菌实验结果13
2.6对生物膜形成的影响14
3结论与讨论 16
致谢17
参考文献18
外排泵AcrA/AcrB对肺炎克雷伯氏菌耐胆盐能力的作用研究
生物技术162 夏丽梅
摘要
肺炎克雷伯氏菌是肠杆菌科克雷伯氏菌属中一类非常重要的条件性致病菌,可引起超过95%的克雷伯氏菌感染所致疾病。它能在人与动物的肠道中定殖，抵抗包括胆盐在内的多种肠道环境压力。本文以转座子随机插入失活的方法构建了一个肺炎克雷伯氏菌突变体文库，筛选出对胆盐敏感的突变株，并采用随机引物PCR法进行序列分析确定转座子插入位点，筛选到基因acrA、acrB缺失株。通过进一步生理实验测定生物学特性。结果显示： 基因acrA、acrB缺失株对胆盐耐受能力大大降低，胆盐能有效抑制二者生长；杀菌实验表明， 基因acrA、acrB缺失会导致菌株在不同生长时期对胆盐耐受性都大大降低，此外，基因acrA、acrB缺失对肺炎克雷伯氏菌形成生物膜能力没有影响，但缺失株形成的生物膜对胆盐抵抗力更弱。综上所述，本研究利用转座子构建肺炎克雷伯氏菌突变体文库，筛选到对胆盐敏感的基因acrA、acrB缺失株，阐明了基因acrA、acrB在介导肺炎克雷伯氏菌对胆盐的耐受度中的作用。
引言
引言
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1 肺炎克雷伯氏菌简介
肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，是肠杆菌科克雷伯氏菌属条件性致病菌中非常重要的一类，属革兰氏阴性菌[1]。该菌呈杆状，短而粗，并且通过包被大量黏性的多糖形成荚膜。肺炎克雷伯氏菌分布广泛，不仅存在于大自然中，在人和动物体内也广泛分布，例如可以从肠道、呼吸道中分离得到[2]。它的致病谱相当广泛，可以引起肺炎、尿路感染等疾病，严重的甚至可以危及生命[3]。目前，肺炎克雷伯氏菌已经为临床治疗带来相当大的挑战，尤其是对免疫力低下的人、刚做完外科手术的易感人群人群以及恶性肿瘤患者，肺炎克雷伯氏菌是他们诱发医源性感染的重要威胁之一。
2 胆盐(Bile salt)的杀菌作用
肺炎克雷伯氏菌能够定殖于人与动物的肠道，从进入机体到成功定殖，无疑要克服许多挑战，例如由胃酸引起的极端pH环境、肠道内的低氧水平、肠道内与益生菌进行的营养竞争、机体的分泌物威胁等等。其中，胆盐是机体分泌的一种重要物质，能够进入肠道抵御肠道病原菌。在正常的生理条件下，胃肠道中胆盐的残留量约为0.05% 2%[4]，因此，能否抵御胆盐的杀菌作用是肠道病原菌是否能够顺利定殖肠道的重要因素之一。毫无疑问，肺炎克雷伯氏菌正是具备一定程度的胆盐耐受能力，才能顺利定殖，对临床治疗带来挑战。
胆盐即胆汁酸的钠盐或钾盐。肠道菌酶催化初级胆酸，通过去结合反应将其转化为次级胆酸，再通过肽键与氨基酸（甘氨酸或牛磺酸）结合，形成甘氨胆酸或牛磺胆酸，这就是胆汁酸。胆汁酸与胆固醇、胆盐一起共同组成了胆汁。胆汁由肝细胞分泌，通常在胆囊内储存和浓缩。进食后机体进入消化期，胆汁随即被排入肠道，以促进消化和营养物质的吸收。


图1 胆汁酸的形成图[5]
目前已有多项研究表明，胆盐对许多微生物的生长具有抑制作用，这主要作用在对微生物细胞膜的损伤。其中最具说服力的是红细胞实验，众所周知，成熟红细胞不具备细胞器，因此没有办法摄取和代谢胆盐。实验表明，向红细胞中加入胆盐会引起溶血，这无疑只能归因于膜化作用[6]。不同的胆盐浓度对细胞膜造成的影响也不尽相同。低浓度胆盐会引起细胞膜流动性和渗透性的改变，从而导致细胞膜完整性遭受破坏。而高浓度的胆盐会引起细胞膜的迅速溶解，这种溶解作用因为是瞬间发生，会导致细胞内细胞质等物质流出，进而导致细胞死亡[7]。在电子显微镜中也能观察到，细菌暴露在胆盐环境中，细胞会发生萎缩，这也证明了这一观点。此外，在对细菌胆盐敏感型突变体的研究中发现，大多数突变体发生突变的基因都与细胞膜完整性有直接或间接的关系。这些都表明，胆盐能够对细菌细胞膜造成损伤，改变细胞膜的完整性和渗透性。


图2 胆盐对细菌的作用示意图[8]
除了对细菌细胞膜的影响，胆盐也能从其他方面影响细菌的生长，例如干扰细胞大分子的稳定性。这主要作用在以下几个方面：①胆盐能够诱导RNA二次结构的形成。②有报道指出，细菌和哺乳动物细胞中与DNA修复有关的酶能够被胆盐激活[9]，这表明胆盐也有诱导DNA损伤的作用。③胆盐具备去垢作用，能造成蛋白质的错误折叠和变性，干扰细胞生长。④胆盐能够通过产生氧自由基引起细胞的氧化应激反应，产生应激蛋白。对大肠杆菌的研究中就发现，胆盐能够激活应激反应以抵消胆盐的作用，如诱导应激基因soulA，能停止细胞分裂，修复由于胆盐造成的细胞损伤。Leverrier等人的研究也发现，在胆盐诱导的11种应激蛋白中，有3种在氧化损伤修复中发挥作用。⑤此外，胆盐能够螯合钙与铁[10]，影响细胞生存。

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