目录
摘要III
关键词III
ABSTRACTIV
KEY WORDSIV
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.1.1 实验菌株和载体2
1.1.2 主要使用的酶及试剂2
1.1.3 常用培养基及溶液配制方法2
1.1.4主要设备与仪器仪器3
1.2 实验方法 3
1.2.1 目的蛋白基本信息分析及引物的设计3
1.2.2 PCR扩增目的基因4
1.2.3 重组质粒的构建5
1.2.4 重组质粒转化E. coli DH5α感受态细胞5
1.2.5 重组质粒的筛选鉴定6
1.2.6 蛋白的诱导表达6
1.2.7 小量蛋白纯化7
2结果与分析8
2.1 目的蛋白基本信息8
2.2 目的基因PCR扩增及扩增产物纯化结果8
2.3扩增产物的双酶切结果8
2.4 全长蛋白11880重组质粒的构建及表达纯化9
2.4.1 pET24b11880重组质粒的构建及表达纯化9
2.4.2 pCold11880重组质粒的构建及表达纯化10
2.5 胞外感受器结构域蛋白11880(20298)的重组质粒的构建及表达纯化12
2.5.1 pET24b11880（20298）重组质粒的构建及表达纯化12
2.5.2 pET28aMBP11880（20298）重组质粒的构建及表达纯化13
3 讨论15
3.1 研究双组分系统的必要性15
3.2 膜蛋白的诱导表达15
3.3 亲和层析纯化蛋白15
致谢16
参考文献17
双组分调节系统11875/11880中激酶11880体外表达和纯化的初步研究
摘要
双组分系统是细菌体内最重要的信号转导系统，该系统在细菌的生长、繁殖、环境适应和致病性上起着非常重要的作用。组氨酸激酶是双组分调节系统的组分之 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ￥351916072$ 
一，它起着感受环境信号并通过磷酸化传递信号的作用。在连四硫酸盐存在的情况下，沙门氏菌中双组分系统TtrSR中的组氨酸激酶TtrS能够感受连四硫酸盐信号，并通过相应系统将连四硫酸盐还原成硫代硫酸盐，并从中获得能量促进致病菌的增殖。本研究将沙雷氏菌FS14中TtrS的同源蛋白11880的全长蛋白和胞外感受器结构域蛋白11880(20298)，在E. coli C43(DE3)中进行了异源诱导表达，结果显示，含pCold11880 和pET28aMBP11880(20298)重组质粒的大肠杆菌分别表达出约64 kDa和约72 kDa的蛋白，这两种蛋白的大小与理论值相符。本研究随后还通过NiNTA亲和层析对这两种蛋白进行了初步纯化。该结果为将来研究TtrS如何感受外界信号，进而了解组氨酸激酶TtrS的作用机制奠定了基础。
引言
微生物生活在多种多样的环境中，为了应对动态变化的外界环境，需要具有即时感应外界环境信号变化并作出响应的能力，双组分调节系统(Twocomponent system)就是细菌体内存在的最重要的信号转导系统。
双组分调节系统是1986年，Ninfa 和Magasnik在研究大肠杆菌氮代谢调节时发现的[56]，它主要包括两个组分，分别是组氨酸激酶和反应调控蛋白。双组分系统是通过两个组分之间的识别和磷酸转移实现信号传递的，组氨酸激酶的感受器结构域能够检测到体内外刺激，从而调控传递器结构域的活性，催化依赖ATP的组氨酸残基发生自我磷酸化，并随后将组氨酸残基上的磷酸基团转移到反应调控蛋白的天门冬氨酸残基上，使受体调节蛋白的构象发生变化，从而使其可以作为转录因子调节下游被调控基因的转录或与蛋白相互作用调节其它应答反应[14]。
尽管双组分系统主要由这两个组分组成，但实际上细菌体内的双组分系统组成有时并不只有两个,还具有额外的辅助蛋白[7]。如磷酸转移蛋白，组氨酸激酶自磷酸化后会先将磷酸基团逐级传递给下游的磷酸转移蛋白，再转移至反应调控蛋白，譬如SLN1家族中的反应调控蛋白便是接受从磷酸传递蛋白Ypd1传递而来的磷酸基团[19]。
双组分调节系统TtrSR最初是在沙门氏菌中被发现的。该系统包括组氨酸激酶TtrS和反应调控蛋白TtrR，在连四硫酸盐存在的情况下，组氨酸激酶TtrS可以感受到外部信号即连四硫酸盐并自我磷酸化，再将磷酸基团转移到反应调控蛋白TtrR，磷酸化的TtrR与含RNA聚合酶的σ70因子相互作用，激活连四硫酸盐还原酶操纵子ttrBCA的转录，完成整个信号转导过程。研究表明，当沙门氏菌进入肠道后会产生致病因子，引起肠炎，吸引嗜中性粒细胞在炎症处聚集，产生活性氧，将内源性硫化合物硫代硫酸盐氧化为连四硫酸盐[11]。因此，通过TtrSR系统，沙门氏菌可以利用连四硫酸盐还原酶将连四硫酸盐再还原成硫代硫酸盐，并通过这个过程在肠道的厌氧环境中获得能量并生长，使其比其它依赖发酵的竞争性微生物更具生长优势，从而促进沙门氏菌的增殖及传播。

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/606368.html