β-半乳聚糖酶水解半乳聚糖产生低聚半乳糖，广泛应用于食品、多糖结构分析以及药物指纹图谱构建。本文对来源于Paenibacillus xylanexedens的β-1,3-半乳聚糖酶px1,3Gal进行克隆并探究其酶学性质。通过PCR扩增出px1,3Gal基因，全长为1788bp，编码595个氨基酸。基因片段连接至pET29a转化至E.coli BL21(DE3)，在大肠杆菌中实现px1,3Gal的可溶性表达。通过镍柱亲和层析纯化重组px1,3Gal，以oNPG为底物，该酶的比酶活力最高，为12.39±0.41 U/mg，最适反应温度为50 ℃，最适pH为7.0。该研究结果拓展了对β-1,3-半乳聚糖酶的认识，为其工业应用奠定理论基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.1.1 菌株与质粒2
1.1.2 引物2
1.1.3 培养基2
1.1.4 实验仪器与设备3
1.2 实验方法 3
1.2.1 基因px1,3Gal的克隆3
1.2.2 构建基因px1,3Gal的表达菌株4
1.2.3 诱导表达及纯化px1,3Gal5
1.2.4 蛋白含量测定5
1.2.5 px1,3Gal的酶学性质测定6
2 结果与分析7
2.1 β1,3半乳聚糖酶基因px1,3Gal的克隆7
2.2 表达载体pET29Apx1,3Gal的构建7
2.3 酶px1,3Gal的诱导表达与纯化8
2.3.1 px1,3Gal的诱导表达8
2.3.2 px1,3Gal的纯化9
2.3.3 px1,3Gal的蛋白定量9
2.4 px1,3Gal的酶学性质的测定10
2.4.1 以oNPG为底物测定px1,3Gal的酶活力10
2.4.2 px1,3Gal的最适温度10
2.4.3 px1,3Gal的最适pH10
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2.4.4 px1,3Gal的底物谱11
3 讨论11
致谢12
参考文献12Paenibacillus xylanexedens来源β1,3半乳聚糖酶的克隆表达与酶学性质研究
引言
β半乳聚糖酶广泛存在于原核生物和真核生物中，为糖苷水解酶（Glycoside hydrolases, GH, EC3.2.1）家族的一员，它主要对半乳聚糖这类底物进行酶解，作用于半乳糖残基间的糖苷键，生成的产物为βD半乳糖或低聚糖片段。β半乳聚糖酶根据作用部位连接键型的不同可分为三类，分别是：β1,3半乳聚糖酶、β1,4半乳聚糖酶和β1,6半乳聚糖酶；它还可依据水解糖基的最小单元不同分为两类，分别是：随机识别特定糖苷键并释放低聚糖片段的内切β半乳聚糖酶、特异识别非还原末端上的特定糖苷键并释放βD半乳糖的外切β半乳聚糖酶[1]。
在最近十年中，有关β1,3半乳聚糖酶和β1,6半乳聚糖酶研究的文章数量迅速增加，在β1,3半乳聚糖酶相关研究中，主要集中于外切β1,3半乳聚糖酶。外切β1,3半乳聚糖酶具有良好的底物特异性，大部分作用于β1,3半乳聚糖时活性最高[2]，尤其是针对于阿拉伯半乳聚糖（Arabinogalactan, AG）可发生较完全的酶解，它作用于非还原末端上带有或不带有β1,6半乳聚糖侧链的β1,3乳糖残基，并生成半乳糖、β1,6半乳聚糖侧链的低聚糖及其衍生物[3,4]。氨基酸序列和结构相似性分析表明，外切β1,3半乳聚糖酶属于GH 43家族。国内外研究学者已对来源于不同细菌（如：长双歧杆菌[2]和热纤梭菌[5]）和真菌（如：黄孢原毛平革菌[4]、尖孢镰刀菌[6]、白囊耙齿菌[7]）的外切β1,3半乳聚糖酶进行克隆和鉴定。结构分析表明已鉴定的外切β1,3半乳聚糖酶的C端均含有一个碳水化合物结合结构域（carbohydratebinding module，CBM）[2]，例如来源于热纤梭菌的Ct1,3Gal43A在CBM结构域识别底物后改变空间构象并在GH43催化结构域对底物进行酶解[8]。与外切β1,3半乳聚糖酶相比，内切β1,3半乳聚糖酶研究较少。后者属于GH 16家族，最早被发现于金针菇中，来源于黄曲霉和克雷索菌的内切β1,3半乳聚糖酶也已被克隆和鉴定。研究表明，β1,3Gal3是该酶识别的最小底物。内切β1,3半乳聚糖酶的催化活性基序为EXDX(X)E，此外酪氨酸残基在内切β1,3半乳聚糖酶中保守存在，参与该类酶的底物识别[9]。
β半乳聚糖酶的底物半乳聚糖存在于植物多糖中，如：阿拉伯半乳聚糖蛋白（Arabinogalactanproteins，AGP）[9]、果胶[10]。AGP是一类由AG与蛋白质连接的植物蛋白聚糖，位于细胞表面[11]，存在于高等植物的所有组织中[6]，参与花粉管生长、细胞分化、细胞扩增和抗逆性生理过程，但AG在其中所起的作用仍有待探究。研究发现植物中多种糖苷水解酶为外切酶，不能完全降解AG，而微生物来源的β半乳聚糖酶对AG进行较为完全的降解[9]，有利于探究分析其分子结构和生理功能。此外，β半乳聚糖酶在食品行业中有较大的应用潜力，其酶解产物低聚半乳糖作为一种重要的益生元，可调节人体肠道有益细菌菌群生长，维持人体肠道健康稳态[12]。同时，该酶还可作为食品添加剂用于果汁中，酶解分子量大的多糖，从而减少固形物的含量，降低果汁浑浊度，改善果汁的口感和质量[13]。β半乳聚糖酶还是构建药用指纹图谱时较为重要的一种工具酶，通过酶解得到的特异性产物来判断药用植物的种属、生长方式、活性和品质等特征[14]。但目前有关β半乳聚糖酶的研究发现，该酶普遍具有表达量偏低、酶活力偏低的缺点[13]，因此，发现并探究不同微生物来源的β半乳聚糖酶具有重要意义。
本课题通过基因组挖掘从Paenibacillus xylanexedens中筛选到一个新型的GH43家族β1,3半乳聚糖酶基因px1,3Gal，序列分析表明其具有糖苷水解酶第43家族（GH43）催化结构域、及FA58C超家族以及Fascin超家族非催化结构域，对该酶的酶学性质进行研究，将拓展对β1,3半乳聚糖酶的认识，并为该酶应用于工业方面筑牢理论根基。
1 材料与方法

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