致病疫霉引起的马铃薯晚疫病具有毁灭性和爆发性的特点，是全球非谷类农作物的第一大病害。致病疫霉致病力强，能在短期内杀死寄主植物，但其致病机理至今未研究清楚。随着二代测序出现和普及，利用RNA-Seq技术研究致病疫霉侵染马铃薯过程中基因转录水平上的变化，对研究致病疫霉的致病机制有重要意义。本实验利用英国田间优势菌株Blue-13对马铃薯品种DM的侵染样品进行RNA测序，分析致病相关基因在侵染不同时间点的转录表达变化，为进一步揭示晚疫病致病相关基因的作用机制，田间马铃薯抗性基因部署提供指导。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1建立并确定侵染条件2
1.2 RNA样品制备与分析2
1.2.1样品选取2
1.2.2 RNA提取2
1.2.3 RNA测序与数据分析3
2 结果与分析3
2.1各样品比对情况及reads数目分布3
2.2致病相关基因在侵染过程中表达水平的变化6
2.3差异基因分析及GO富集分析6
2.4致病相关基因在侵染过程中转录情况10
3讨论 10
3.1 RNA测序结果质量不高10
3.2 差异基因分析11
3.3 Cdc14在侵染过程中的表达差异12
3.4 RNASeq与PenSeq结合诊断田间致病疫霉株12
致谢12
参考文献12
图1 致病疫霉侵染马铃薯叶片的过程3
图2 reads数目在各样品中的分布及PCA分析结果5
图3 致病相关基因在侵染不同时间点的表达差异6图4 侵染后不同时间点间差异基因分析7图5 差异基因聚类分析及部分差异基因GO富集结果9
图6 致病相关基因在侵染不同时间点的表达差异以及reads覆盖情况10
图7 侵染24小时后Blue13中marker基因的reads覆盖度情况11
表1 四个时间点样品测序基本参数的比对情况4
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疫霉Blue13菌株侵染DM马铃薯叶片转录组分析
引言
引言：致病疫霉起源于拉丁美洲，与丝状真菌在分类上不同，隶属于卵菌门疫霉属，能引发马铃薯晚疫病，是一种全球性的植物病原物[1]。1845年，马铃薯晚疫病在欧洲大面积爆发，导致爱尔兰大饥荒[2]。致病疫霉基因组已于2009年公布[3]。
致病疫霉通常是异宗交配的二倍体，只有当A1和A2两种交配型的同时存在时，才可以通过有性生殖形成卵孢子。有性生殖可以增加致病疫霉的遗传多样性并产生可以作为土壤中初侵染源的卵孢子，为病原体传播提供优势[4,5]。A2交配型在欧洲的出现要比A1交配型晚135年[6]，且一直不常见，这大大限制了病原菌有性繁殖的机会。但是从研究发现，从2006年到2008年，在英国马铃薯晚疫病高发地区，一种新型的A2交配型的致病疫霉菌株Blue13迅速取代了A1交配型菌株在当地致病疫霉种群中的主导地位，拥有巨大的田间优势[7]。Blue13主要通过无性生殖实现这一显著的变化[8]。对Blue13进一步研究发现其具有甲霜灵抗性，且在低温下与其他菌株相比更具有破坏力。使用包括Blue13的不同菌株对同一寄主进行侵染，发现Blue13的活体营养阶段比其他菌株时间更长，这也意味着Blue13菌株引起的晚疫病病害在田间更不易被发现[7]。
致病疫霉携带的无毒（Avirulence, Avr）基因能够被植物携带的相应的抗病（Resistance, R）基因特异性识别，激发寄主植物的免疫反应[9]。因此，利用致病疫霉的Avr基因和马铃薯的R基因间的特异性识别机制进行抗性育种对于防治晚疫病十分重要。然而马铃薯晚疫病变异速度快，往往能快速克服马铃薯品种抗性、产生抗药性，造成“治理爆发再治理再爆发”的恶性循环。所以在生产上急需可以快速、准确且廉价的诊断田间晚疫病的检测技术，尽早为马铃薯抗病品种部署提供指导，减少马铃薯晚疫病造成的损失。
二代测序( nextgeneration sequencing) 的面世使得测序通量增加、成本降低[10]。其中RNASeq技术具有很大的潜力，可以解决真核生物中的时空、组织特异性或条件特异性转录组学问题[11，12,13]，是将基因信息与其功能建立联系的重要工具。目前RNASeq技术主要应用于转录分析、SNP鉴定、RNA编辑和差异基因表达分析[14]。随着诸如Salmon、Kallisto等非比对软件的发展，RNASeq定量分析的速度以及准确性都大大提升[15,16]。这一类软件使得分析基因的基因和转录本表达情况更加方便。这不仅可以研究致病疫霉侵染样品中病原菌致病相关基因的转录本时空表达情况，还可以分析寄主植物免疫的相关基因的转录本表达情况以及为应对致病疫霉侵染，寄主植物免疫的相关基因的可变剪切信息[17]。
本实验以DM马铃薯作为寄主植物，使用近年来在英国致病疫霉种群中占据主导地位的菌株Blue13模拟田间马铃薯晚疫病发病条件侵染DM马铃薯叶片，并对侵染样本进行了RNA测序，希望可以通过RNASeq数据，从转录水平上研究侵染样品中Blue13致病相关基因在不同时间点表达情况，发现致病疫霉侵染马铃薯寄主的过程中，致病相关基因的表达水平变化以及基因表达变化与侵染过程中植物表型的内在联系，为田间马铃薯抗性基因分布提供指导。
1 材料与方法
1．1 建立并确定侵染条件
为了研究致病疫霉侵染马铃薯叶片过程中基因表达水平的变化，实验决定在马铃薯叶片受侵染后的不同时间点对受侵染的叶片采样并进行RNAseq。使用致病疫霉Blue13对3个月大的DM马铃薯叶片进行侵染，侵染时间长达5天，并在侵染后的4 hpi，8 hpi，12 hpi，24 hpi，48 hpi和96 hpi取样（图1.1A）。直接通过肉眼观察表型和台盼蓝染色来确定侵染进程，台盼蓝染色后叶片出现的蓝色斑点对应植物死亡的细胞内的致病疫霉菌丝，证实了致病疫霉侵染过程已进入死体营养阶段（图片1.1B）。在分子水平上，为确定致病疫霉的侵染进程，利用管家基因ActinA（PITG_15117）对表达量进行标准化，选用Hmp1（PITG_00375）和Avr3a（PITG_14371）作为标记基因，进行PCR验证。 PCR结果显示在96hpi可以观察到Hmp1的条带，24hpi可以观察到Avr3a的条带，证实了侵染进程（图1.1C）。Hmp1和Avr3a的RTqPCR结果显示24 hpi后两个标记基因的表达量明显上升，尤其是Avr3a（图1.1D）。

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