目录
摘要1
关键词1
Abstract2
Key words2
引言3
1 材料与方法4 1.1实验材料4
1.2实验方法5
1.2.1构建MtREA1的CRISPR/Cas9敲除载体 5
1.2.2 截形苜蓿的遗传转化7
2结果与分析8
2.1 MtREA1的CRISPRCas9敲除载体的构建8
2.2截形苜蓿遗传转化实验9
3 讨论11
3.1利用基因编辑技术对作物进行改良11
3.2遗传转化实验11
3.3转基因植株的解铝毒能力12
3.4展望12
致谢13
参考文献13截形苜蓿MtREA1敲除突变体材料的创建
摘要
截形苜蓿是研究豆科植物遗传学的模式植物，其植株再生时间较短，遗传转化效率高。作为目前最受欢迎的一种基因编辑技术，CRISPR/Cas9能够对控制作物优良性状的基因进行直接且有目的的筛选。本研究采用截形苜蓿野生型R108作为实验材料，构建MtREA1的CRISPR/Cas9敲除载体，采用农杆菌介导的截形苜蓿遗传转化体系，将REA1的CRISPR/Cas9载体通过农杆菌侵染转入截形苜蓿，获得转基因植株。REA1是抗铝毒关键转录因子STOP1的负调控因子，本课题的研究目标即通过基因编辑技术敲除MtREA1，为研究苜蓿REA1基因的功能提供材料，为创制耐酸铝的苜蓿材料提供基础。
引言
在目前的情况下，人类面临的最关键的挑战是为不断增长的人口提供足够的食物，并确保粮食安全。据研究学者预测，2050年的世界总人口将突破90100亿，因此全球粮食需求量也将大大增加，增幅约60100%[1]。除人口增长，极端天气，农业用地减少外，不断增加的生物和非生物胁迫是农业和粮食生产的重大制约因素。例如：病原微生物施加的生物胁迫对抗病作物的发展构成了严峻的挑战，占潜在产量损失的42%以上，占全球粮食产量下降的15%[11]。发展有助于作物改良的技术可以增加作物产量，在某种程度上利用物理、化学和生物(TDNA插入/转座子)诱变的遗传操作技术在过 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: #351916072# 
去几十年里对研究基因的作用和确定作物品种改良的生物学机制作出了重大贡献[2]。然而，将转基因整合到宿主基因组中具有一定的非特异性和不稳定的，并且民众对于转基因食物安全问题存在较大争议[3]。基因编辑技术即基因组编辑，该技术通过人为操作精准修饰基因，编辑特定基因的插入、删除或替代。
在过去的十年中，基因组编辑技术中的特异性位点核酸酶(SSNs)得到广泛应用，该酶能够实现基因的精确编辑，并在动物和植物中得到了成功验证。特异性位点核酸酶能够使靶DNA序列形成双链断裂(DSB)[5]，断裂的双链通过同源定向重组(HDR)途径或非同源末端连接(NHEJ)得到修复，在修复过程中可进行基因的缺失、插入或替换[4]。与传统转基因作物相比，这种改良作物可以用于育种计划，产生的品种可以直接使用，监管程序也相对较少[6]。
CRISPR（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats）基因编辑系统的发现彻底改变了动物和植物生物学的研究，为作物育种工作带来新的曙光[3]。CRISPRCas9基因编辑技术能够精确、高通量地编辑目标基因从而实现定向育种，并且不引入外源基因，目前在农作物育种领域表现出巨大的潜力和价值。缩略语CRISPR[12]指的是在大肠杆菌基因下游首次观察到的具有非重复DNA延伸的串联重复[7]。在2005年，这些非重复序列被发现与来自质粒和噬菌体的外来DNA序列同源，与细菌和古菌的获得性免疫相关[8]。与ZFNs（Zinc Finger Nucleases）和TALENs（Transcription Activatorlike effector, TAL effector）不同，CRISPR基因组编辑更直接，通过设计一个大约20个核苷酸的引导RNA (gRNA)来补充目标基因内的DNA延伸。
CRISPR的切割方法需要(i)短合成的gRNA序列与靶DNA序列结合，该短合成gRNA序列由20个核苷酸组成，(ii) Cas9核酸酶在原pacer邻近motif (PAM)后切割34个碱基(一般50 NGG)[3]，Cas9核酸酶功能的实现主要依靠两个核酸酶结构域，分别是RuvC结构域和HNH结构域，这两个结构域可以分别切割一条DNA链。随着CRISPR切割方法学的发展，其在植物和动物基因组编辑中得到了广泛的应用。从2010年到2020年，有5000多篇文章详细介绍了CRISPR1的使用。实现CRISPR项目需要简单的步骤，即(i)识别目标基因中的PAM序列，(ii)合成单个gRNA (sgRNA)，(iii)将sgRNA克隆成合适的二值载体，(iv)引入宿主物种/细胞系的转化，然后进行(v)筛选和(vi)编辑品系的验证。CRISPR/Cas9介导的基因组编辑(CMGE)中涉及的简单步骤甚至可以让一个小型实验室通过基本的植物转化来开展基因组编辑项目[9]。在植物方面，大多数编辑已在模式物种如拟南芥、水稻和烟草上得到证实，作物品种方面，目前已在近20个作物品种中发展了CRISPR/Cas9基因编辑方法，用于提高产量、增强抗逆性等[10, 13]。针对铝毒害的危害，本文主要想探讨通过单基因的CRISPR/Cas9基因组编辑，是否能提高苜蓿对铝毒的抗性。
由于植物的耐铝性是由多个基因共同作用的结果，且不同植物在抗酸铝能力上有较大差异，通过对比植物间的不同，我们就能够发现一些抗酸铝性的基因，它们通过介导有机酸分泌参与外部排铝，而另一些耐铝基因则是通过筛选Al3+敏感突变体得到的[15, 16]。STOP1是关键的抗铝毒核心基因，在高等植物中功能保守，如：水稻同源基因ART1、大豆GmSTOP1等都参与调控耐铝性。STOP1（SENSITIVE TO PROTON RHIZOTOXICITY1）是控制耐铝基因表达的核心转录因子家族，其结构为Cys2His2型锌指，有研究发现拟南芥stop1突变体幼苗对铝胁迫和酸胁迫极度敏感[17]。在铝胁迫下，STOP1能够调控耐铝基因MATE1、ALS3 (aluminium sensitive 3)和一些耐H+基因，因此stop1突变体表现出对铝毒害和低pH极度敏感[17, 18]。近年来，紫花苜蓿对铝毒的抗性研究取得了一些进展，主要关注有机酸分泌。依托于基因芯片杂交，有研究发现，铝胁迫会引起紫花苜蓿根部MsMATE基因的表达量大大增加，并且该基因的表达量与铝胁迫程度和铝胁迫时间有关，同时，研究表明，MsMATE突变体对铝胁迫极度敏感。由此可证明，MsSTOP1转录因子在紫花苜蓿的耐铝机制中发挥重要作用，主要通过调控紫花苜蓿耐铝基因MsMATE的表达，从而增强了紫花苜蓿的耐铝性[14]。

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