鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis，DVH）是雏鸭的一种高度致死性急性传染病，鸭肝炎病毒A型（Duck hepatitis A virus，DHAV）是该病重要的病原，但目前关于DHAV复制周期的研究尚未见报道。因此本研究分别通过实时荧光定量PCR和电子显微镜法检测病毒含量和形态变化，监测DHAV在鸭胚肝细胞中的吸附、复制和释放等。结果发现DHAV在感染鸭胚肝细胞90 min时完成吸附，完整的复制周期出现在吸附后的6-11 h，而且经过11-13 h的平台期后，病毒粒子释放出细胞外。在病毒吸附的过程中，细胞表面可见球形的，直径约50 nm的病毒颗粒。由此得到DHAV在鸭胚肝细胞中的复制周期，及病毒吸附细胞的形态变化，丰富了鸭肝炎病毒的生物学特性，也为今后的研究奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 1
1　材料与方法3
1.1　材料 3
1.1.1主要试剂 3
1.1.2　鸭肝炎病毒（DHAV）及鸭胚 3
1.1.3　主要仪器 3
1.2　方法 3
1.2.1　鸭胚肝细胞的制备及DHAV的感染3
1.2.2　在复制过程中DHAV基因表达的动态变化4
1.2.2.1　病毒吸附实验 4
1.2.2.2　病毒复制实验4
1.2.2.3　病毒释放实验4
1.2.3　RNA的提取及cDNA的合成4
1.2.4　实时定量PCR5
1.2.5　病毒吸附过程中的形态观察5
1.2.6　数据分析5
2　结果与分析5
2.1　 鸭胚肝细胞的形态观察5
2.2　 吸附过程中DHAV基因表达的动态变化6
2.3　 复制过程中DHAV基因表达的动态变化7
2.4　 释放过程中DHAV基因表达的动态变化8
2.5　 病毒吸附过程的观察9
3　讨论 10
4　结论 12
致谢12
参考文献12
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图1 不同状态的鸭胚肝细胞6
图2 吸附过程中DHAV基因表达的动态变化7
图3 复制过程中DHAV基因表达的动态变化8
图4 释放过程中DHAV基因表达的动态变化9
图5 DHAV在吸附鸭胚肝细胞过程中的形态特征10
鸭肝炎病毒在鸭胚肝细胞中的复制周期
引言
鸭是我国主要的传统养殖家禽之一，近年来，我国的养鸭业得到了迅速的发展，目前我国鸭的存栏量已经超过10亿，占世界总存栏量的70%以上，成为了世界养鸭大国。鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis, DVH）是一种急性、传播迅速、高发病率和高度致死性传染病，同时也是一种人类肝炎疾病研究的理想模型。主要侵害3周龄内的雏鸭，以48日龄的雏鸭最易感染，而成年鸭则呈隐性感染，无临诊症状，但能排毒，传播该病。病鸭常发生痉挛，头向背部后仰，多呈角弓反张样外观，俗称“背脖病”，同时肝脏常有特征性出血性病变[14]。该病于1949年在美国被首次发现后[5]，世界其他地区也相继出现了该病的报道。在中国，该病于1963年被首次报道，并在1984年被郭玉璞等人证实北京地区流行的鸭病毒性肝炎病原为DHV1[6]。
鸭病毒性肝炎是由三种不同血清型的鸭肝炎病毒引起的，分别是鸭肝炎病毒1型（DHV1），鸭肝炎病毒2型（DHV2）和鸭肝炎病毒3型（DHV）[78]，而且它们之间没有共同抗原。在第九次国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV）报告中，DHV1被重命名为DHAV，并被划分到微RNA病毒科中一个新的属，即禽肝病毒属（Avihepatovirus）中[9]，同时DHV2 和DHV3被划分到星状病毒科，并分别被命名为DAstV1和DAstV2[1011]。DHAV是这三种病毒中毒力最强，分布最广的，而DAstV1和DAstV2分别只在英国和美国分布。DHAV的病毒颗粒小而简单，直径约30纳米[12]，没有囊膜，二十面体对称，球形，具有不分节段的单股正链RNA，约7.8 kb，被包裹在无囊膜的衣壳中[1314]，胞浆内繁殖。其基因组基本结构为：5UTRVP0VP3VP12A12A22B2C3A3B3C3D3UTR，具有典型的微RNA病毒科病毒基因组的结构特点[1516]。DHAV可以使3周龄内的雏鸭出血，肝脏坏死，甚至使其死亡，危害极大。DHAV可分为三类：呈世界型分布的经典株DHAV1，在台湾分离到的DHAV2，在南韩和中国分离到的DHAV3[1718]。
近年来，随着养鸭业不断向产业化、集约化和规模化方向发展，饲养方式也由粗放型转变为集约型，饲养密度加大，使得水禽的生长环境恶化，降低了鸭群的免疫力，同时也利于病毒在个体之间的传播且提高了病毒变异几率，DHAV给养鸭业带来了巨大的威胁，并且造成了严重的损失。
众所周知，病毒的复制是个极其复杂的过程，包括病毒的吸附，穿入，亲本病毒的复制及子代病毒的释放[19]。以微RNA病毒科中研究最为详细的脊髓灰质炎病毒为例，在病毒感染细胞的过程中，吸附敏感的宿主细胞是病毒复制的第一步。这个过程包括静电吸附和特异性吸附两个极端。当病毒与宿主细胞表面的特异性受体结合后，可被细胞吞饮，形成内吞小体，然后进入胞浆，将病毒的基因组释放到细胞质中，并产生一系列蛋白质RNA的相互作用。接下来，病毒RNA作为翻译的模板，产生聚合蛋白，再进而分裂成11个独立的蛋白。其中一部分是病毒结构蛋白，构成病毒的衣壳，另一部分是非结构蛋白，包括RNA依赖的RNA聚合酶。这些非结构蛋白和众多的宿主蛋白，及病毒RNA基因组构成了复制复合物。复制复合体在双层膜的小泡的表面来指导病毒RNA的合成[20]。简单来讲，在复制复合体的作用下，病毒RNA作为复制的模板被翻译成有限数量的负链RNA，然后负链RNA被用来产生很多子代正链RNA。先前翻译的病毒结构蛋白形成病毒的壳粒，经过酶的加工，可自我组装形成衣壳，进而包装子代正链RNA形成核衣壳，生成的新的病毒粒子蓄积在胞浆中，成熟后，从宿主细胞中释放[2123]。但目前为止，对DHAV的生物学特性[24]及其复制过程知之甚少，给DVH的防控，及降低其对养鸭业的危害带来了巨大的困难，因此，要进一步解决该病的防治问题，须对鸭肝炎病毒有更深入的了解。
本实验采用实时定量PCR分别检测病毒吸附、复制及释放过程中DHAV病毒基因的相对表达量的动态变化，同时通过电子显微镜技术观察DHAV病毒在鸭胚肝细胞复制过程中的形态，以得到鸭肝炎病毒在鸭胚肝单层细胞上的复制周期，为鸭病毒性肝炎的防控提供了资料，同时也为今后的研究奠定了基础。

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