细胞分裂素主要通过信号转导途径在植物生长发育中起重要作用。虽然细胞分裂素在水稻中的信号转导途径已被阐明，但还没有关于构建水稻中细胞分裂素信号输出报告系统的相关研究。目前已有研究报告成功构建了一种双组分信号传感器(TcsnTCSn)应用于拟南芥中的细胞分裂素信号检测系统中。但是，这种信号传感器能否在水稻中应用是不清楚的。因此，我们构建了一个应用于水稻中的灵敏的、鲁棒性可视化强的强化水稻体内细胞分裂素信号检测系统，其中含有由合成启动子TCSn启动的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)。由于细胞分裂素主要与植物细胞的分裂分化有关，检测发现TCSn::GUS在萌发种子和水稻苗的分生区GUS表达活跃。而且水稻苗中的TCSn::GUS的表达受外源细胞分裂素诱导，所以我们主要检测TCSn::GUS在发芽水稻种子分生组织和水稻幼苗中表达。在水稻幼苗中TCSn::GUS明显的被外源细胞分裂素所诱导且被外源生长素所抑制。故因此我们成功构建了可以灵敏检测水稻体内细胞分裂素信号输出的感受器在水稻中的细胞分裂素信号检测系统。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1 载体的构建和植物转化2
1.2实验材料的生长条件及处理2
1.3 转基因水稻组织的总RNA提取、反转录和qRTPCR反应3
1.4 GUS的组织染色和GUS活性定量测定4
1.5数据分析4
2 结果与分析4
2.1拟南芥与水稻中typeB响应因子中类似Myb结构域氨基酸比对4
2.2对水稻中typeA OsRRs 启动子上DNA结合结构域的分析4
2.3水稻根部和地上部中的typeA RRs基因对不同种类激素的响应 5
2.4 TCSn::GUS在野生型水稻体内的表达模式6
2.5 TCSn::GUS对不同种类细胞分裂素的响应7
2.6 TCSn::GUS对细胞分裂素的响应具有特异性9
3 讨论10
致谢10
参考文献11
构建水稻体内细胞分裂素信号检测系统 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 

引言
细胞分裂素是植物体内重要的调控因子，与植物的生长、发育有密切联系[1]。研究表明，细胞分裂素作为植物体内调控氮素吸收、转运与代谢的主要长距离传递的信号因子之一，对植物的形态、生理及产量有重要调控作用[2]。细胞分裂素调控细胞的分裂需要依赖细胞分裂素的信号传导途径，而植物体内的细胞分裂素的信号传导机制是一种类似于真核生物和原核生物中的双元组分系统的磷酸转移反应[3][4]。在拟南芥中细胞分裂素的信号传导途径一般包含4个步骤，首先细胞分裂素受体组氨酸蛋白磷酸酶HKs结合细胞分裂素后自磷酸化，并将磷酸基团有激酶区保守的组氨酸残基转移至信号接收区保守的天冬氨酸残基上；其次天冬氨酸上的磷酸基团被传递到细胞质中的磷酸转运蛋白HPs上，然后磷酸化的磷酸转运蛋白进入细胞核并将磷酸基团转移到TypeB RRs响应因子上，最后再正向调控TypeA RRs和下游响应细胞分裂素基因的表达，但是TypeA RRs基因的表达具有反馈抑制TypeB RRs响应因子的作用[5][6]。但人们对于植物体内不同时期不同部位的细胞分裂素信号传导的情况不是非常清楚。主要原因是植物体内细胞分裂素浓度的难以测定，而且物体内活性态的、结合态的细胞分裂素及其它代谢产物含量水平是非常低的，甚至在同一个植物部位的细胞分裂素比生长素低上百倍[7]。目前在拟南芥中使用一个人工合成的报告元件（TCSn）可以去检测细胞分裂素转录水平的信号输出，能很好的在野生型的植物生长过程中观察到细胞分裂素的作用的位点[8]。定位在核里的TypeB RRs是响应磷酸信号的正向转录因子，可以正向的启动TypeA RRs的表达，但也会受到TypeA RRs的反向抑制。不过在TypeA RRs家族的启动子区域内含有与TypeB RRs转录因子结合的保守DNA序列，经过一系列的体外试验验证发现 (A/G)GAT(T/C) 是主要的核心碱基序列，也是该人工合成元件（TCSn）的核心成分[9][10]。水稻不仅是世界上主要的粮食作物，而且它的基因组小且全基因组测序已完成，所以可以看做单子叶物种研究的模式植物[11]。虽然水稻的细胞分裂素信号途径已被研究的比较清楚了，但目前还没有研究给出一个可以检测水稻体内细胞分裂素信号的系统。目前在拟南芥中已经报道了一个可以检测细胞分裂素信号传导的人工合成报告元件（TCSn），但它是否同样能在水稻里检测细胞分裂素的信号传导是不清楚的。因此，本文首先进行了拟南芥与水稻中typeB RRs响应因子中类似Myb结构域氨基酸比对。再者分析了水稻TypeA RRs启动子序列里与TypeB RRs结合的DNA元件(5′(A/G)GAT(T/C)3′)，也检测了TypeA RRs对不同激素的响应状况。我们通过遗传转化的方法把强化版的TCSn::GUS转入到水稻植物体内，并外源施加不同种类的细胞分裂素和不同种类的植物激素来验证TCSn::GUS报告系统是否可靠。结果证明我们所使用的报告系统是完全可以在水稻体内体现细胞分裂素信号的真实作用的。
1 材料与方法
1.1 载体的构建和植物转化
TCSn的启动子序列参照文献[12]，在金唯智公司人工合成序列。我们所用的原始载体是由中国杭州浙江大学实验室提供的pDR5::GUS载体。先利用SalI和BamHI酶切开这两个酶切位点，把合成的TCSn的启动子装载到这个载体上。把装在好的载体转化到农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105上。在N6培养基上诱导水稻胚性愈伤组织，通过农杆菌共培养转化水稻胚愈伤组织。最后用该菌株侵染野生型水稻品种（Shiokari）的愈伤组织。
1．2 实验材料的生长条件及处理
转基因种子经10% H2O2表面消毒30 min后，用去离子水清洗3遍，每遍5分钟。消毒后的种子放在在清水中育苗一周，然后选择地上部及根系涨势均一致的小苗，然后移栽至 pH5. 5的国际水稻所（IRRI）改进营养液里培养2周： (1.25 mM NH4NO3, 0.1 mM KH2PO4, 0.45 mM K2SO4, 1 mM CaCl22H2O, 1 mM MgSO47H2O, 0.5 mM Na2SiO3, 20 μM NaFeEDTA, 20 μM H3BO3, 9 μMMnCl24H2O, 0.32 μM CuSO45H2O, 0.77μM ZnSO47H2O and 0.39 μM Na2MoO42H2O)。每隔2天换一次营养液，植物生长在白天温度控制在30 °C ，光照时间16个小时。夜间温度控制在22 °C，黑暗时间8小时。生长室里相对空气湿度控制在70%左右。

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/563349.html