随着盐碱地区直播稻和机插秧等简约栽培模式的推广，水稻种子萌发耐盐性品种匮乏的难题亟待解决。然而水稻萌发期生理机理较为复杂，不易研究，表型性状也不易观察。目前，水稻耐盐性相关研究虽已有不少报道，且克隆了SKC1、OsRR22、OsHAK21等多个基因，但尚不知晓是否与种子萌发有关。本研究通过对水稻种子耐盐萌发QTL位点进行验证和精细定位分析，挖掘盐胁迫下控制种子萌发的相关基因。前期利用高活力籼稻品种乌脚粘与低活力粳稻日本晴构建的BC1F2群体进行QTL分析，发现在6号染色体上存在控制种子耐盐萌发的主效QTL位点qGR6。本研究利用BC2F2群体对其进行了验证，将qGR6定位在Z6-4与Z6-5之间，这与初定位结果一致。并利用BC2F3、BC2F4群体对其进行精细定位，将qGR6初定位在分子标记Z6-17、Z6-19之间，其物理距离为299.65kb。发掘高盐胁迫下影响种子萌发的相关基因为后续水稻种子耐盐萌发相关基因的克隆和功能分析奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法3
1.1 实验材料 3
1.2 种子萌发期耐盐性鉴定3
1.3 DNA提取3
1.4 PCR扩增体系4
1.5 丙烯酰胺凝胶电泳4
1.6 分子标记开发4
2 结果与分析4
2.1 亲本种子活力萌发鉴定5
2.2 精细定位6
3 讨论7
3.1 材料特异性7
3.2 位点真实性7
3.3 育种利用7
致谢7
参考文献8
水稻种子萌发期高耐盐主效位点qGR6的精细定位
引言
引言
长久以来盐害是影响作物产量的重要非生物胁迫因子之一[1]。据联合国教科文组织（unesco）部分统计，全球盐碱地面积现已达954.38亿平方米，约占全球陆地面积的25％。盐碱地分布在世界各大洲的干旱地域，主要散布在欧洲，亚洲，北美洲西部和非洲。中国的盐碱地面积约 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
为9,913万平方米，植物难以在盐碱化严重的土地中生存。土壤中高浓度的盐是世界各地大量减产的重要原因之一。在15亿公顷耕地中，据统计有7700万公顷（约占全部耕地的5％）受盐影响。灌溉土地特别危险，大约三分之一的土地因盐碱化而严重受损。虽然这是一个相对较小的地区，但估计灌溉的土地产生了世界三分之一的食物。
进行盐碱地栽培是处置，改良，利用土壤盐渍化的有效途径。因此，大力培养新的耐盐水稻品种，同时充分开发利用盐碱地对于增加粮食生产，资源利用，农业收入，粮食安全，耕地战略和生态环境建设具有重要意义。经由育种方法培育耐盐性是降低稻米盐害和提高盐碱产量的一种经济有效的方法[2]。但对于植物耐盐性QTL定位的研究还只是刚刚起步[4]。
在植物的根部以外其他部位，如果存在高浓度的Na+会引起植物的一些渗透和新陈代谢问题。由于根部的Na+浓度低于地上部分，因此叶片相比于根系更容易遭受Na+的伤害。Na+的代谢毒性在于它能够与K+竞争细胞功能所必需的K+结合位点。K+参与植物体日常的重要代谢过程。50余种酶需要K+来激活，而K+这种功能不能被Na+替代。因此，高浓度的Na+或高Na+/K+比率可破坏细胞质中的各种酶活性。种子萌发是种子生物学研究的重要内容之一。随着盐碱地区直播稻和机插秧等简约栽培模式的推广，水稻种子萌发耐盐性品种匮乏的难题亟待解决。
用于QTL分析的作图群体可分为临时性群体和永久性群体两大类群体。在耐盐QTL分析研究中，常用的永久性群体以重组自交系RILs和渐渗系ILs为主[6]。Huang等人将控制dst突变体耐盐性的突变体位点定位至水稻第3染色体分子标记H2423和H2437之间，大小为14 kb的染色体区间，从而得到一个控制水稻耐盐性的新型锌指转录因子DST[10]。
在之前的实验里通过对高活力籼稻品种乌脚粘与低活力粳稻日本晴构建的BC1F2群体进行QTL分析，在6号染色体上发现存在控制种子耐盐萌发的主效QTL位点qGR6。现利用BC2F2群体对qGR6位点进行QTL验证，并对其进行精细定位，发掘新的影响盐胁迫下种子萌发的相关基因[11] 。1 材料与方法
1．1 实验材料
本研究利用实验室保留的籼稻乌脚粘（萌发期高盐胁迫下种子活力高）为材料，与粳稻品种日本晴（萌发期高盐胁迫下种子活力相对较低）构建BC2F2回交分离群体，进行QTL分析，利用BC2F3、BC2F4群体进行精细定位。技术路线如下



1．2 种子萌发期耐盐性鉴定
成熟期收获种子，挑选健康饱满的种子，待破除种子休眠后，用0.1%的氯化汞溶液表面消毒15 min，再用蒸馏水冲洗三次。将30粒种子均匀放置含有40 mL石英石、20mL 300mM NaCl的9 cm培养皿中，再放入中转箱里，盖上保鲜膜，置于25℃恒温光照培养箱（黑/白各12h）发芽15天，每天统计发芽数，试验设置3次重复。发芽标准为胚根长度大于或等于种子长度同时胚芽长大于等于种子长度一半，据此计算发芽率（GR）。
1．3 DNA提取
参考Doyle(1991)的CTAB法，加以优化,具体步骤如下：
1. 取每个水稻材料幼苗期叶片100mg左右，放入2.0mL离心管，加入液氮研磨成粉末；
2. 加入600µL 65℃预热处理过后的CTAB缓冲液（2%CTAB，100mM TrisHCl，20mM EDTA，1.4M NaCl，pH值8.0），均匀混匀，并每隔5min振荡一次；
3. 取出离心管，加入350µL量的氯仿/异戊醇(24:1)混合液,颠倒混匀；
4. 再次置于65℃烘箱10min；
5. 取离心管，离心机12000rpm离心8min；
6. 吸取上清至新的1.5mL离心管；
7. 加入等体积20℃下预冷异丙醇，混匀后置于20℃环境沉淀1h以上；
8. 离心机12000rpm离心5min，然后弃去上清，再用75%乙醇洗5min；
9. 倒置自然风干后溶于无菌纯水中，并于20℃冰箱中保存。
1．4 PCR扩增体系
PCR扩增反应总体积为10µL,包括1µl DNA模板（10 ng/μl），1µl 10×缓冲液（含25 mM MgCl2），1µl 4 pmol/µl上、下游引物，0.2µl 2.5 mM dNTP，0.1µl Taq DNA 聚合酶（5 U/ μl），加水补足 10µl。反应程序：
(1)95℃预变性5min；
(2)32次循环：95℃变性40s，55℃退火40s，72℃下延伸40s；
(3)72℃下延伸10min。
(4)在4℃下保存

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