低温影响植物的发芽。近年来，在许多亚洲国家推广的直播稻更易受低温侵袭，引起烂芽，幼苗生长缓慢或者死苗现象。在模式植物拟南芥中，转录因子SPATULA与PIL5共同调控拟南芥低温发芽，同时参与调控拟南芥器官大小以及营养生长期的低温响应机制。通过同源比对分析，在水稻中，OsbHLH107与SPATULA最同源，该基因在水稻中尚未被研究。本研究，通过RNA interference(RNAi),CRISPR 技术和水稻遗传转化技术，获得OsSPATULA的RNAi 转基因植株以及CRISPR突变体。通过对OsSPATULA转基因株系的低温发芽鉴定，发现该基因确实参与调控水稻低温发芽力。同时，对已有自然群体的测序数据分析发现，OsSPATULA的主要的单倍体型与粒型，低温发芽力相关联。本论文初步鉴定出OsSPATULA调控水稻低温发芽力，其自然变异与水稻粒型，低温发芽力相关。这些结果将推动对水稻低温发芽力分子遗传机制的研究。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1.研究背景4
2. 材料与方法 4
2.1实验思路 4
2.2材料与工具 4
2.3 实验方法 4
结果与分析 5
3.1 转基因材料鉴定 5
3.2 OsSPATULA 的自然变异与种子粒长显著相关 5
3.3 OsSPATULA 的自然变异与低温发芽力相关 5
讨论 7
4.1 SPATULA在拟南芥中的功能析 7
4.2 SPATULA在水稻中的功能 7
5. 致谢7
参考文献7
SPATULA蛋白在水稻低温发芽调控中的功能分析
种子科学与工程 刘航宇
引言
引言
1研究背景
水稻是世界上主要的三大粮食作物之一，播种面积占世界粮食播种总面积的1/5，年产量占世界粮食总产量的1/4。保持和提高其产量是响应全球气候变迁人口增长的重要目标，而影响水稻产量的一大威胁是低温冷害。水稻起源于热带和亚热 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
带，生长的适宜温度为2530℃，大多数品种对15℃以下低温环境较敏感。 但在很多栽培地区， 如浙江双季稻地区、日本Hokkaido高纬度地区和中国云南低纬度但高海拔地区，经常播种时会遇到15°C以下低温[1,2,3]。近年来，在许多亚洲国家推广的直播稻更易受低温侵袭影响，引起烂芽、幼苗生长缓慢或者死苗现象[4]。全世界每年约有1,500万公顷的水稻在不同生长期，如萌发期、营养生长期、生殖生长期，受到不同程度的低温冷害。培育耐冷品种是解决水稻冷害的最有效途径，因而提高水稻耐冷性已成为当今水稻育种的一个重要目标。
在模式植物拟南芥中，休眠的种子发芽需要光照和低温，缺少光照或者休眠，都不能促进种子发芽。打破休眠的光波长为红光，其信号转导是通过光敏色素途径完成[5,6]。Gibberellin(GA) 对于种子发芽是必须的，外源施加GA能够打破种子休眠并且能够部分替代光照和冷处理[7,8,9]。在吸胀的种子中，光照以及低温调空GA的合成，而GA的合成是通过GA合成酶(GA3ox)感知光照和低温调控的[10,11,12]。已有研究表明光照和低温都能增加种子中GA的合成[12,13,14]。拟南芥中转录因子SPATULA可通过感知光照以及低温抑制GA3ox的表达，从而控制种子响应低温和光照[15]。在成熟植株中，SPT能够显著调控植株再低温下的生长状态[16]。除此以外，SPATULA 也是一个关键的调控器官大小的因子。
在本研究中，我们确定了OsSPATULA确实参与调控水稻低温发芽力以及调控水稻种子大小。RNAi株系的低温发芽力以及种子大小显著低于野生型日本晴。基于RDP1的测序数据以及表型数据发现，该基因的单倍体与水稻低温发芽力以及种子大小存在关联。本研究将推动对水稻低温发芽力的分子遗传机制研究。
2 材料与方法
2．1 实验思路
本研究拟通过RNA干扰，CRISPR 基因编辑技术产生水稻OsSPATULA基因的沉默及突变植株，通过对这些植株在萌发期耐冷性的测定发现OsSPATULA基因与耐冷性的相关性。
2.2 材料与工具
材料：包括野生型日本晴水稻，构建载体所需生化试剂（连接酶，内切酶，PCR体系等），转基因所需生化试剂（培养基，抗生素等）。
工具： 包括高速冷冻离心机、荧光定量PCR仪、PCR仪、光照培养箱、核酸凝胶电泳和成像系统、超低温冰箱等。
2.3 实验方法
(1)产生转基因材料。
研究拟通过RNA干扰，CRISPR 基因编辑技术，产生转基因材料。 利用pTCK303载体构建RNAi载体，PHUE411构建CRISPR载体,通过农杆菌转化体系，转化水稻愈伤组织，产生转基因材料。
(2)确定纯合转基因材料，鉴定表型。
对产生的转基因材料先进行PCR（扩增载体序列）鉴定阳性，对阳性植株（RNAi）进行qPCR表达量鉴定，潮梅素筛选纯合。对阳性植株（CRISPR）进行测序鉴定，鉴定有效突变且纯合植系。通过潮梅素筛选（具有潮霉素抗性基因的植物种子大多发芽并且长势良好，不具备抗性的种子，长势较差），通过测序技术，筛选纯合，表达量有效降低的RNAi转基因株系以及纯合有效突变的CRISPR转基因株系。对纯合转基因材料进行田间表型鉴定以及低温发芽表型的鉴定。
(3)鉴定表型。
对转基因材料鉴定表型，主要是田间基本农艺性状（株高，分蘖，粒型）以及与拟南芥中SPT相关的表型主要低温下的发芽表型。
(4)分析OsSPATULA在RDP1中的自然变异，寻找与表型关联的变异位点。
水稻在不同环境中，通过自然变异和人工选择从而适应不同的环境。通过调查转基因的表型以及已有自然群体的表型和测序数据，可确定OsSPATULA的自然变异与功能变异的关系，从而对其遗传进化以及功能分析具有推动作用。通过三鉴定到的表型，查找RDP1自然群体中与低温发芽表型关联的OsSPATULA的自然变异。将OsSPATULA的不同单倍体型进行回补，确定功能等位基因。培育优异品种。

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