[目的]由于大多数作物在铵态氮营养下，尤其是在单纯的铵或者铵浓度高的营养下会产生中毒症状，因此要提高作物对铵的吸收能力，就要了解作物耐铵的机制[1]。通常情况下，作物大量吸收铵离子之后会导致根际部分泌大量氢离子，因此植物会受到酸的胁迫[2]。而且，铵吸收以后很快就在根系中被同化为氨基酸，并生成大量的氢离子。细胞膜质子泵具有主动排出质子的功能，在这个过程中就可以调节细胞内外的pH值[3]。因此，本项目研究了铵态氮营养下水稻根细胞膜质子泵活性的变化，并通过质子泵基因OSA1超表达的转基因水稻来验证水稻对铵的耐受能力和吸收能力，为研究作物耐铵的机制提供理论依据 。[方法]本研究用不同浓度的铵态氮营养培养水稻幼苗，采用两相法分离水稻根系细胞膜，测定细胞膜质子泵活性在铵态氮下的变化特征，用western blot的方法测定质子泵蛋白浓度，并用real time PCR的方法测定水稻根系中各个质子泵基因的表达差异。[结果]随着铵离子浓度的提高，水稻在4mM的铵浓度以上也会出现生长受到抑制，并且质子泵活性也受到影响，说明水稻耐铵能力与质子泵的活性有一定的关系。而且，相对于硝态氮，铵态氮营养下质子泵活性更高，这主要是由于其蛋白浓度高，质子泵基因表达水平高所决定的。[结论]质子泵活性高低是决定作物是否耐铵的关键因子。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1材料与方法 2
1.1实验材料与培养方法 2
1.2细胞膜分离 2
1.3质子泵活性测定 3
1.4质子泵在翻译水平上的变化 3
1.5水稻质子泵基因的表达分析 3
2结果与分析 4
3讨论 6
致谢 8
参考文献 8
细胞膜质子泵在水稻耐铵机制中的作用机理研究
引言
引言
氮铵（NH4+ N）和硝态氮（NO3－N）是作物根系吸收的两种最重要的氮素形态。然而，植物对铵和硝的吸收是由其生长环境所决定的[4]。 在通气土壤中硝化作用强烈，铵态氮的比列低于硝态氮[5]。 在淹水的土壤或酸性土壤中，由于硝化作用受到限制， *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
而且存在反硝化作用，因此铵态氮比硝态氮的含量要高得多[6]。 对于大多数植物而言，在铵态氮营养下发生铵的中毒[7]。植物铵中毒的原因很多，例如在根细胞中吸收大量NH4 +所需的碳支架不足[8]，这与植物地上部分的光合作用能力有关，可能限制了碳源向地下部分的运输。另外Yan等人研究发现白羽扇豆根系质子泵活性会受到缺磷的强烈诱导[9]。 因此，添加α酮戊二酸有时可以减轻铵中毒，但对所有植物并不都具有同样的效果。 还有研究认为光合磷酸化和氮代谢过程不一致是铵中毒的原因，研究表明光合磷酸化过程与氮代谢过程不一致，但一直存在争议。 此外，NH4+的吸收减少了根系对其他阳离子如K +，Mg2 +和Ca2 +的吸收，也可能是铵中毒。相对来说，根系的NH4+吸收导致根区强烈酸化，这是植物中常见的现象和铵中毒的重要原因。
根际酸化主要与NH4+的吸收模式有关，即H+和NH4+的反向转运或NH4 +蛋白质转移以NH3的形式进入细胞。 基于阴离子和阳离子的吸收平衡理论，由于NH4+带正电，根系必须在NH4+吸收时释放相同量的H+[10]。无论哪种方式，都会导致根际pH下降。
当根际的pH显着降低时，在质外体H+浓度增加，并且部分H+通过细胞膜进入引起细胞质酸化[11]。 此外，根系中NH4+的同化也导致H+的大量生成[12]，因此NH4+的同化也导致细胞质pH下降。 如果植物不能通过某些生理和生化相互作用调节细胞质pH，它们将影响细胞中不同的生理代谢过程[13]。为了维持细胞质pH稳定性，细胞质中的H+通过不同的生理途径消耗，或者在液泡中积累，或者再次排出细胞。
植物细胞质膜上的质子泵（H + pump）或H+ATPase（EC 3.6.1.35）是一种转运蛋白，通过ATP产生能量并将H+逆浓度泵出细胞外。质子泵的主要功能是在细胞膜的两侧产生H+浓度梯度和膜电位，以质子驱动力的形式促进各种不同离子和小分子代谢物的转移[14]。此外它还具有一些重要的生理功能，就是根据膜电位的变化把细胞代谢过程中产生的酸 (H+) 排泄到细胞外[15]。理论上，细胞膜的质子泵可以无限地把H+排到根际中。
综上所述，本课题就是通过研究质膜H+ATPase的活性与表达，提示其在水稻耐铵中的调控机理。
1.材料与方法
1．1实验材料与培养方法:
实验材料是水稻，品种是日本晴 (Oryza sativa L. ‘‘japonica’’)及以日本晴为背景的水稻质子泵OsA1基因超表达株系。所有植物材料利用水培方法，在温室中生长，光照时间为14小时，温度是28±1ºC。水稻从生长时开始进行用铵培育，营养液利用国际水稻研究所（IRRI）常规营养液配方。准备四个铵态氮水平（1mM, 2 mM, 4mM, 8mM NH4+）。根系取样进行分析和液氮速冻, 80 ºC保存备用。
1．2细胞膜分离:
采取培养15天的水稻根系样品，洗去表面上的杂质、称取极富活力的水稻根系20 g左右，加入4倍体积（w/v）预冷的研磨缓冲液(含50 mmolL1 BTP (1,3二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷)MES (2吗啉乙磺酸)(Sigma)，pH 7.8)、2 mmolL1 EGTA（乙二醇（2氨基乙基）四乙酸）、0.5%(w/v) BSA（牛血清蛋白）、0.25 mmolL1 KI 、250 mmolL1蔗糖、0.6%(w/v) PVP（聚乙烯吡咯烷酮）K30、10%(v/v)甘油、5 mmolL1 2巯基乙醇、2 mmolL1 DTT (二硫苏糖醇)、1 mmolL1 PMSF（苯甲基磺酰氟），冰浴中研磨，匀浆用4层纱布过滤后，11 500 g离心10 min，弃沉淀；上清液于87 000 g下离心35 min，弃去上清液。用6 mL磷酸缓冲液（含5 mmolL1 KH2PO4 (pH 7.8)、100 mmolL1 KCl、250 mmolL1蔗糖）悬浮沉淀后，加入由右旋糖苷（Dextran）T500（Sigma）和聚乙二醇（PEG）3350（Sigma）的水溶液组成的两相分离系统（含6.1% (w/w) Dextran T500和3350，5 mmolL1 KH2PO4 (pH 7.8)、100 mmolL1 KCl、250 mmolL1蔗糖），来回摇动30次以混匀。4℃ 720 g离心，每次离心结束将分层后的上相转移到新的两相系统中，离心时间依次为23，15，10，5 min，最后将上相中收集到的膜蛋白用磷酸缓冲液稀释6倍，151 200 g下离心40 min。将沉淀用BTP缓冲液（含5 mmolL1 BTP/MES (pH 7.8)、250 mmolL1蔗糖、3 mmolL1 KCl）溶解后再次在151 200g下离心40 min，收集到的膜蛋白用12 mL BTP缓冲液溶解后分装，液氮速冻，置于80℃中保存。以上所有操作过程均在04℃下进行。所用离心机为BECKMAN COULTERＯptimumTM L80 XP，转头为SW32 Ti。

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