NO3-在促进植物生长发育过程中，不仅起到营养的作用，同时它还作为一种信号调控植物的生长发育。通过对OsMADS57的突变体和超表达不同氮浓度和氮形态条件下的研究发现，与野生型相比，0.2 mM NO3-的条件下OsMADS57突变体根系变短，生物量降低，而在5 mM NO3-和0.2 mM NH4+条件下水稻生长并没有受到影响。通过对氮浓度、15N和伤流液硝酸盐的测定发现，与野生型相比，0.2 mM NO3-的条件下OsMADS57突变体硝态氮由根系向地上部的转运受到抑制，而硝态氮的吸收没有改变，0.2 mM NO3-处理条件下的OsMADS57超表达植株NO3-根系向地上的转运增加。检测0.2 mM的条件下NO3-相关的转运蛋白基因的表达发现，与野生型相比，OsMADS57突变体中OsNRT2.1/2.2/2.3a/2.4表达下调，OsMADS57超表达植株OsNRT2.1/2.2/2.3a/2.4、OsNAR2.1、OsNia1/2表达均上调。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
1引言3
2材料方法4
2.1实验材料 4
2.2OsMADS57突变体鉴定 4
2.2.1osmads57TDNA插入突变体的鉴定4
2.2.2 CRISPCAS9介导突变体的获得5
2.3OsMADS57超表达材料的创建5
2.3.1 OsMADS57超表达载体的构建5
2.3.2 OsMADS57超表达材料的鉴定 6
2.4突变体和超表达植株表型及氮素含量分析 7
2.4.1 突变体和超表达不同氮浓度条件下对水稻植株生长和氮素积累的影响 7
2.4.2 突变体和超表达植株不同氮浓度条件下15N的吸收和转运 7
2.4.3突变体和超表达植株不同氮浓度条件下木质部伤流液的收集7
2.4.4 突变体和超表达植株N浓度的测定7
2.4.4.1突变体植株NO3N浓度的测定7
2.4.4.2 突变体植株全氮浓度的测定8
2.5突变体和超表达植株相关基因表达分析8 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 

2.6数据处理8
3结果与分析9
3.1.突变体和超表达材料的获得及分子鉴定9
3.1.1.突变体材料的获得和分子鉴定9
3.1.2.OsMADS57超表达材料的分子鉴定10
3.2.突变体和超表达材料的表型分析及氮素积累11
3.2.1.突变体不同硝态氮浓度条件下的表型分析及氮素积累11
3.2.2 突变体不同N形态条件下的表型分析及氮素积累13
3.2.3.OsMADS57超表达材料不同硝态氮浓度条件下的表型分析及氮素积累14
3.3.OsMADS57沉默突变体和超表达植株15N的吸收与转运16
3.3.1.OsMADS57沉默和超表达材料的15N吸收16
3.3.2.OsMADS57沉默和超表达材料15N的积累16
3.4.OsMADS57沉默突变体和超表达植株伤流液中硝态氮的转运量17
3.5OsMADS57沉默突变体和超表达植株相关基因的表达18
4讨论19
致谢 20
参考文献20
水稻转录因子OsMADS57对水稻氮素积累的影响
引言
尽管水稻是喜铵作物，但是水稻的根系实际是在NH4+、低浓度NO3混合营养中[1]。有研究表明，增硝营养利于水稻的生长[2]。MADS是一类规模庞大而且高度保守的基因家族，在动物、植物和真菌中都有该家族基因的存在。在水稻中已经发现了近75个MADSbox转录因子[3]。
拟南芥中，AGL17like亚家族基因主要是参与调控植物营养器官的发育。AGL21参与促进侧根的发育，尤其是在缺氮条件下agl21会严重抑制侧根的发育[4]。水稻中，AGL17like亚家族基因OsMADS25依赖于NO3促进根系的发育，同时促进植物体内的硝态氮积累。前期结果表明，水稻中AGL17like亚家族中OsMADS57主要在营养器官中表达，而且受NO3诱导表达，那OsMADS57是否参与NO3调控水稻的生长呢？
为进一步研究OsMADS57基因功能，我们获得了3个TDNA插入的突变体株系，构建CRISPRCas9介导的突变体，获得7个纯合体株系。同时通过转基因手段创建OsMADS57超表达株系，获得了2个稳定遗传的T2代单拷贝株系。我们将以水稻TDNA插入突变体中敲除效果较显著的2个株系和超表达的2个单拷贝株系为材料对OsMADS57的功能做进一步研究。
2 材料方法
2.1实验材料
供试水稻品种：东粳背景的TDNA插入突变体：MT1和MT2；东粳野生型。
主要试剂：Ca(15NO3)2，Trizol（Invitrogen）；atm%=40%（上海化工研究院）；逆转录酶MMLV（Fermentas）；dNTP、Taq DNA polymerase、内切酶BamHI、SacI、T4 DNA连接酶（Takara）。
osmads57 TDNA插入突变体的获得：来自韩国水稻突变体库。
供试菌株：根癌农杆菌和大肠杆菌均由本实验室提供。
2.2 osmads57突变体鉴定
2.2.1 osmads57TDNA插入突变体的鉴定
无菌苗的发芽：将购得的突变体和野生型种子去皮后在超净台中于无菌三角瓶中经70%的乙醇消毒1 min，30% NaClO浸泡30 min，然后无菌去离子水冲洗67遍，浸泡30 min后，将种子转移到无菌吸水纸平板上晾干，最后将种子转移到1/2 MS固体培养基中。
待苗长至2叶一心，提水稻基因组DNA，采用用两轮PCR法对TDNA插入突变体进行鉴定。osmads57 TDNA插入突变体3个株系所用的TDNA都是pGA2715。采用网站给出的TDNA插入位置两侧的序列引物（F和R）以及边界引物（LB）（表1）对TDNA突变体进行鉴定。回收鉴定为纯合体的PCR产物送去测序，通过比对TDNA序列和OsMADS57基因序列找到每个突变体株系的插入的具体位置
TDNA突变体敲除效果鉴定：同时采集长势一致的TDNA插入纯合突变体和野生型水稻植株叶片提RNA反转录以插入位点两端设计引物（RTF和RTR）通过RTPCR的方法鉴定（引物见表1）。

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