米糠脂多糖的提取纯化以及活性鉴定
摘要
米糠脂多糖是一类具有多种生物活性以及生理功能的物质，本文探讨了超声波辅助法分离提取米糠中的脂多糖的最佳工艺条件，并在最佳条件下对粗提取的米糠脂多糖又进一步进行了纯化和活性鉴定。首先，以米糠为原料，采用热水浸泡以及超声波辅助提取技术，通过单因素变量试验确定了超声波辅助提取米糠脂多糖的最佳工艺条件。最佳提取条件为：热水提取温度：90℃，超声波处理时间：20min，超声波提取功率：385w,料液比：1:20，总提取时间：2h。 其次将提取的米糠脂多糖用鲎试剂进行了活性鉴定。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:米糠米糠脂多热水浸泡超声波提取纯化
目录
1. 引言 1
2．材料与仪器 4
2.1材料 4
2.2仪器 4
3.实验方法 5
3.1多糖的测定方法 5
3.2蛋白质的测定方法 5
3.3脂多糖的测定方法 5
4.结果分析 7
4.1热水浸泡提取多糖 7
4.1.1多糖的获得和浓度检测 7
4.1.2葡萄糖标准曲线的绘制 7
4.1.3热水浸泡获得的多糖含量 8
4.2超声波辅助提取多糖 8
4.3超声波辅助提取单因素实验 8
4.3.1超声波提取时间对米糠多糖得率的影响 9
4.3.2超声波的功率对米糠多糖得率的影响 10
4.3.3料液比对米糠多糖得率的影响 11
4.3.4总提取时间对米糠多糖得率的影响 12
4.3.5乙醇的加入量对米糠多糖得率的影响 13
4.4原液中淀粉的去除 15
4.5原液中蛋白质的去除 15
4.6脂多糖的分级沉淀 16
4.7脂多糖的鲎试剂检测 16
4.7.1鲎试剂标准曲线的绘制 16
4.7.2脂多糖含量的鉴定 17
5.结论 19
5.1超声波辅助提取与热水浸泡提取对比 19
5.2超声波辅助提取最佳工艺条件 19
5.3鲎试剂检测脂多糖的结果 19
6.参考文献 20
7.致谢 21
1. 引言
米糠脂多糖是多糖的一种，存在于植物，动物以及微生物当中。据不完全统计，我国每年的米糠产量在1000万吨，而它是大面积的可循环利用的资源。但是，我国对于米糠的研究处于较低的水平。因此，研究米糠，分离提取米糠当中的有效成分米糠脂多糖，这不仅可以为后续的实验提供原料，而且在研究米糠脂多糖的功效上也有十分突出的意义。
米糠当中主要成份是糖类，油脂，和蛋白质。与此同时里面还含有较多的灰分和维生素。而所提取的米糠脂多糖当中也有明确的功能因子，和确切的保健功能。据了解，米糠脂多糖具有降血脂，降血糖，美容保健，增强免疫力，和抗癌等功效。不仅如此，米糠脂多糖还可以作为工艺生产的前体原料，而米糠脂多糖在分离提取过程中的副产物也可以循环利用。随着科学技术水平的不断提高,以及人们对于米糠脂多糖研究的不断深入， 我们有理由相信“米糠脂多糖”将具有广阔的发展前景。
研究表明，米糠中富含有铁，镁，锰等多种微量元素。糖类，植酸，肌醇，谷维素，膳食纤维，维生素B等多种营养物质［1］。由于米糠具有特殊的营养价值，而它的营养价值又与各种成份密切相关，因此，对米糠进行分离提取，就具有了重要的理论意义和应用价值。
脂多糖在自然界中分布较为广泛，植物体，动物体，微生物体当中都含有脂多糖。而脂多糖的结构分为特异性O-抗原多糖侧链，核心寡聚糖，和类脂A3，而类脂A又由磷酸化的β-（1,6）-D-葡糖胺二糖与脂酰基连接而成，高度保守，且很难被特异性免疫系统识别［3］。类脂A也是脂多糖内毒素的核心结构，是使脂多糖具有活性的最小结构［4-6］。微生物当中含有的脂多糖大多是覆盖于革兰氏阴性菌外膜的一类多糖大分子,由三部分组成:类脂A、O特异性抗原链(O specific cha-in)、核心寡糖(core oligosaccharide),其中类脂A为LPS的活性部位和毒性部位,KDO(2 keto 3 de-oxyoctonate)为LPS特征组分。而本论文研究的是米糠中的脂多糖，即米糠脂多糖。所谓的米糠脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)［7］ 是脂多糖的一个类别，是米糠当中的一种成分。而在米糠中发现的米糠脂多糖RBS30F则为无色晶状粉末,无味无臭,溶于水后成乳白色,水溶液呈中性或弱酸性,主要由单一的葡萄糖组成,主要通过A1,6键相连,含少量蛋白质和矿物质,分子量超过100万。主要成分为RON、RIN和R5［8-10］。
米糠脂多糖的性质［11-13］：米糠脂多糖为固体化合物，其位于细胞壁的最外层，覆盖于细胞壁的黏肽上，因此只有用人工的方法破坏植物细胞后才能释放出来。其自身也具有一定的耐热性（温度高于40摄氏度会变性），抗原性较弱［14］。
米糠脂多糖具有抗肿瘤,抗病毒，增强免疫力，促进营养成分吸收等作用。同时还可作为食品和化妆品的天然添加剂，如甜味剂、抗氧化剂及食用色素等。米糠脂多糖的甜味较蔗糖高了将近 200倍，为人工合成甜味剂和寻找甜味剂新资源提供了线索。王丽英［15］，对米糠脂多糖作为添加剂进行了相关研究，发现其较之抗生素和化学合成类添加剂有几个明显优点：一是能够调节机体免疫机能；二是几乎无有害残留或有害残留较低；三是资源丰富，来源广泛。发展米糠脂多糖类添加剂，生产天然、安全、健康的动物性食品，对于我国饲料工业、畜牧业和人类健康都具有重大的现实意义和历史意义。
现阶段，米糠脂多糖的提取一般可以对挤压膨化后的脂多糖进行热水浸泡，通过米糠脂多糖的水溶性，而将米糠中的脂多糖带出。但是传统的热水提取法获得的米糠脂多糖的得率并不高，所以本实验采用超声波辅助提取的方式，来进一步提高米糠脂多糖的得率。
超声波法的原理是：超声空化作用对细胞膜的破坏有助于米糠脂多糖的释放与溶出，超声波使提取液不断翻滚，有助于溶质的溶解，不仅如此由于超声波的热效应，可以使得水温有所提高，对原料有水浴作用，因此超声波法不仅大大缩短了提取时间，而且提高了有效成分的提取率。
由于超声提取法具有提取时间短、效率高、无需加热等优点，近年来已广泛用于米糠脂多糖类化合物及其他天然活性成分的提取，如红枣核中总黄酮、银杏叶总黄酮、山楂总黄酮的提取等［21-23］。
目前对米糠脂多糖类化合物的提取研究报道并不是很多，研究内容多为热水浸泡提取法。但经比较发现热水浸泡提取法的时间是最长的，而且操作复杂；耗时长，不适合应用于大规模生产。超声波辅助提取法的时间是最短的，提取效率也较高。而超临界CO2萃取主要特点是提取率高，产品不含有害物质，无污染，但由于超临界提取要求的条件严格，设备复杂，生产成本高。且提取物中多糖的含量较高，给后来的脂多糖的精制造成了影响，目前仍不能进行规模化生产。相对而言，超声波法辅助提取法操作简单易行，提取时问短。此外，利用对米糠脂多糖的吸附和解吸能力，通过离子交换色谱法分离精制米糠脂多糖也取得了很好进展［24］。同时，一些新兴提取脂多糖的技术研究如半仿生提取法、酶解法等也处于探索实验阶段，有待进一步深入研究。
总之，米糠脂多糖的功效多样，具有很高的研究价值。对于米糠脂多糖的分离提纯技术的研究，有利于米糠脂多糖的大量生产和应用。因此，本文采用了超声波波辅助提取法提取米糠中的脂多糖，以期为开发利用米糠脂多糖，进一步研究其理化性质，及其营养价值的评估提供重要的参考。
2．材料与仪器
2.1材料
原料：米糠，蒸馏水
试剂：淀粉酶，无水乙醇，三氯乙酸，葡萄糖，氢氧化钠，氯化钠，氯化氢，牛血清蛋白，3,5-二硝基水杨酸
2.2仪器
BEL电子天平；冰箱；PerkinElmer紫外可见分光光度计；FQ-ⅡD超声波细胞粉碎机（南京菲奇工贸）；HHS型指针式电热恒温水浴锅（上海电子光学技术研究所）；数显电热恒温多用箱（沪粤科学仪器厂）
原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/swgc/6058.html
