为建立快速准确的猫杯状病毒血清抗体检测方法，研制新型猫杯状病毒疫苗，本研究对VP1截短蛋白F进行了原核表达、纯化及多抗制备，并检测血清多抗的效价和生物活性。将编码截短蛋白F的基因克隆到pET-32a (+)载体，原核表达出重组F蛋白。用Ni2+亲和层析法获得纯化的重组F蛋白，免疫新西兰大白兔后获得兔抗F蛋白多克隆抗体。经间接ELISA检测，血清多抗的效价达112800，western blot结果表明制得的血清多抗可与重组F蛋白发生特异性结合。重组F蛋白具有良好的抗原性，可作为猫杯状病毒血清抗体间接ELISA检测方法建立和新型疫苗研制的候选蛋白，血清多抗也为深入研究VP1的生物学功能奠定了基础。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words 2
引言2
1 材料与方法3
1.1 材料3
1.2 方法3
1.2.1 猫杯状病毒截短蛋白F基因片段的扩增3
1.2.2 重组质粒pET32aF的构建3
1.2.3 重组F蛋白的表达4
1.2.4 重组F蛋白的纯化4
1.2.5 兔抗F蛋白多抗的制备4
1.2.6 兔抗F蛋白多抗的效价检测4
1.2.7 Western blot对兔抗F蛋白多抗的生物活性检测 4
2 结果与分析5
2.1 FCV F基因的扩增5
2.2 重组质粒的构建与鉴定5
2.3 重组F蛋白的表达与纯化6
2.4 兔抗F蛋白多克隆抗体的效价测定6
2.5 兔抗F蛋白多克隆抗体的生物活性检测7
3 讨论7
致谢9
参考文献9
猫杯状病毒衣壳蛋白VP1的截短表达及多抗制备
引言
猫杯状病毒（Feline calicivirus, FCV）是一种可感染猫的无囊膜单股正链RNA病毒，基因组大小为7.7kb，是杯状病毒科（Caliciviridae）、水疮性病毒属（Vesivirus）的成员之一，发病典型症状为上呼吸道症状和口腔溃疡，也可引起猫发热、胃肠炎、肺炎、跛行 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
、流产等[1, 2]。FCV不仅可感染猫，也可感染狮、虎、豹等猫科动物。FCV具有较高的变异性，强毒力的毒株引起的系统性疾病（virulent systemic disease, VSD）有较高的死亡率，在多个国家流行[24]。目前市场上的FCV疫苗多为基于单一毒株的弱毒苗或含佐剂的灭活苗，如FCV F9和FCV 255[5]。但近几年强毒株VS FCV的多次流行表明了FCV F9和FCV 255免疫保护的局限性，VS FCV甚至可发生在经免疫的猫群中。因此有必要研制更高效更安全的新型疫苗。目前，FCV的检测方法有病毒分离、 RTPCR、 RTqPCR、 ELISA和间接免疫荧光技术等，其中ELISA检测方法具有简单、快速、灵敏、准确等优势，但是国内尚无商品化的FCV血清抗体ELISA检测试剂盒，间接ELISA诊断方法的建立将有助于FCV的检测、监测及防控。
在FCV复制过程中，除了含三个开放型阅读框（ORF）的全基因型RNA，还存在仅含ORF2、ORF3的亚基因型RNA（Subgenomic RNA, sgRNA）。ORF1编码大小为200 kDa的多聚蛋白，经病毒编码的蛋白酶切割后产生多种非结构蛋白，包括p5.6, p32, p39, p30, p13（VPg）和p76[6, 7]。ORF2和ORF3则编码FCV的衣壳结构蛋白。ORF2编码的蛋白前体在病毒蛋白酶作用下切除大小为14 kDa的前导衣壳蛋白（leader of the capsid, LC），从而产生FCV主要的衣壳结构蛋白VP1，ORF3编码的VP2被认为是次要的衣壳结构蛋白[810]。
VP1由544个氨基酸残基组成，包含了三个结构域，分别为NTA, S和P，P又可细分为P1和高变区P2[11]。有研究发现P区可与细胞表面受体猫接合黏附分子A（Feline junctional adhesion molecule A, fJAMA）相互作用，发生构象变化，进而病毒入胞[12]。根据不同FCV毒株的相似性，FCV的衣壳蛋白可分为AF六个区，其中F区高度保守，位于病毒表面，含有非中和性抗原表位[13, 14]。蒋艳妹等[15]发现B、E、F三区含有较多的抗原位点，且F区编码的截短蛋白F为优势抗原片段。
本项目对截短蛋白F进行原核表达，制备兔抗重组F蛋白血清多抗，并测定其效价及生物活性，这为FCV新型疫苗的研制和FCV血清抗体间接ELISA检测方法的建立奠定了基础，也为进一步研究VP1生物学功能提供了生物材料。
1 材料与方法
1.1 材料
猫杯状病毒（FCV）2280株，大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21 (DE3)，pET32a (+)质粒由大学免疫研究所保存；LA TaqTM、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒等购自TaKaRa（大连）公司；Sac I、Xho I限制性内切酶、T4连接酶购自NEB公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；HRP标记羊抗兔IgG抗体购自Santa Cruz公司；新西兰大白兔1只，30日龄，1 kg，雌性，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司。
1.2 方法
1.2.1 猫杯状病毒截短蛋白F基因片段的扩增
参考GenBank上发表的FCV 2280株基因序列设计合成引物，引物序列为: F:5’ATTGAGCTCCTGGGTTACACAGGAATTGGT3’，下划线为Sac I酶切位点，R:5’ ATACTCGAGTCATAATTTTGTCATACTACT 3’，下划线为Xho I酶切位点。扩增片段大小为432bp。PCR反应条件设置为：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，72℃最终延伸10 min，其中变性、退火、延伸设为35个循环。
1.2.2 重组质粒pET32aF的构建
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，用胶回收试剂盒回收扩增产物。用Sac I、Xho I限制性核酸内切酶分别对扩增产物及pET32a (+)双酶切，产物回收后，16℃连接过夜，转化至大肠杆菌DH5α。经PCR鉴定、酶切鉴定及测序后获得阳性克隆重组质粒，命名为pET32aF。

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