精原干细胞是由原始生殖细胞发育为性原细胞后，迁移至曲细精管基膜处形成的雄性生殖系干细胞，其在支持细胞等所组成的微环境中既可以维持自身数量恒定又可以进一步分化形成精子。雄激素受体（AR）是一种在睾丸中广泛表达的甾类受体。雄激素主要通过与支持细胞中的AR结合来调控精子发生，但在生精细胞内是否存在AR及其特异性功能尚有争议。因此本研究以生殖细胞中过表达AR的小鼠（R26hARQ9floxed/+DDX4-Cre）为实验组，以R26hARQ9floxed/+小鼠为对照组，检测二者睾丸组织中PLZF的表达，结果显示在R26hARQ9floxed/+DDX4-Cre小鼠睾丸中，精原干细胞的数量明显少于对照组，表明AR对精子发生存在直接作用，但具体调控机理尚待探讨。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 实验材料 2
1．1．1 实验动物 2
1．1．2 主要试剂 3
1．1．3 主要仪器和器材 3
1．1．4 主要试剂的配制 3
1．2 生殖细胞特异性过表达AR小鼠的获得 3
1．3 PCR验证小鼠的基因型 4
1．3．1 DNA提取 4
1．3．2 PCR 4
1．4 组织固定包埋 5
1．4．1 收集睾丸 5
1．4．2 组织固定包埋 5
1．5 免疫组化 5
1．6 统计分析 5
2 结果与分析 5
2．1 PCR验证小鼠的基因型 5
2．2 实验组与对照组不同日龄小鼠睾丸中AR的表达情况 6
2．3 实验组与对照组不同日龄小鼠睾丸中PLZF的表达 7
3 讨论 8
致谢 9
参考文献 9
生殖系特异性过表达雄激素受体对精原干细胞数量影响的研究
引言
引言
生殖系干细胞起源于由雌雄配子以及形成配子的所有前体细胞组成的一小 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
群原始生殖细胞，雄性动物的原始生殖细胞迁移到生殖嵴后进一步发育成为性原细胞，性原细胞由曲细精管中央迁移至基膜处成为精原干细胞（spermatogonia stem cells, SSCs）[1]。精原干细胞通常是指As型精原细胞，呈圆形或椭圆形，直径9μm左右[2,3]，具有自我更新，维持自身数量恒定及定向分化的潜能，这些功能需要在管周肌样细胞、间质细胞和支持细胞等体细胞所构成的微环境中才能发挥作用。管周肌样细胞主要为曲细精管的收缩提供动力，间质细胞促进SSCs生长、分泌雄激素维持精子发生，支持细胞为精子发生提供支持和营养。早幼粒细胞白血病锌指蛋白（the promyelocytic leukaemia zinc finger, PLZF）[4]在睾丸中的精原细胞中广泛表达，对维持精原干细胞的自我更新有一定的调控作用，因此常用作观察精原干细胞的标志性因子。
雄激素受体（androgen receptor, AR）是一种甾类受体，其基因全长约90 kb，含有8个外显子，7个内含子，由918个氨基酸组成了雄激素受体[5]。Takeda（1990）通过采用单、多克隆抗体技术对雄激素受体进行免疫组化定位得知，AR在雌雄性生殖器官中的表达量最高，而脾脏是所检测的组织当中唯一没有AR表达的组织[6]。在睾丸内，AR不仅在支持细胞、间质细胞和管周肌样细胞等体细胞中表达，在前精原细胞以及精原细胞中也有表达[7]。雄激素可以通过与AR这一转录因子结合使其被激活，进而特异性地在靶组织中发挥作用。
有研究发现，正常情况下AR对增大小鼠曲细精管的内径、增加管壁生殖细胞的层数、促进生殖细胞成熟都有显著作用[8]。敲除AR后降低了受体活化程度，阻碍了精子的发生过程，而当支持细胞中AR发生缺失或者突变时，睾丸下降正常，内外生殖器发育正常，但是生精细胞却大多停留在第一次减数分裂阶段，由此可推断在生精过程中雄激素可通过支持细胞上的AR介导支持细胞与生精细胞之间的信号传递[9,10]。王晓云等对大鼠睾丸雄激素受体的表达进行检测发现，从出生到生后25月龄，管周肌样细胞，间质细胞，支持细胞均显示AR阳性表达，前两者AR阳性的表达强度随大鼠月龄的增大呈现先增强后减弱的趋势，而支持细胞中AR阳性表达强度随生精周期发生变化，表现为随月龄增大而增强[11]。在生精细胞中，AR阳性表达出现在刚出生大鼠的前精原细胞和1月龄大鼠的精原细胞上，部分精子细胞和精子也有表达，且其表达随月龄增加变化明显。
关于对大鼠睾丸的基因表达过程，有研究报道大鼠出生后010天期间，精原干细胞标志性基因的表达出现了显著变化，说明了此阶段为精原干细胞自我更新与分化的重要时期，而AR的表达量从出生后210天逐渐升高，由此推断出在精原干细胞进行自我更新的过程中可能有AR的参与[12,13,14,15]。关于AR过表达情况，有研究表明，在人表皮生长因子受体2过表达型乳腺癌中AR阳性率明显高于对照组[16]，另有研究表明，前列腺癌患者在糖尿病条件下选择性激活AR基因的表达，同时会增强细胞增殖，并导致肿瘤晚期[17]。
虽然有研究表明AR可能对精原干细胞自我更新的过程发挥了一定的作用，但是目前关于在生殖系特异性过表达AR，是否会对精原干细胞的数量产生影响的研究还未见报道，因此本实验以生殖细胞中特异性过表达AR的小鼠为实验对象，通过睾丸组织中AR、PLZF的表达情况进行统计分析得出过表达AR对精原干细胞数量的影响，从而进一步揭示AR对精子发生的直接作用。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 实验动物
过表达AR转基因小鼠由斯坦福大学医学院Zijie Sun教授实验室提供，DDX4Cre小鼠购于南京大学模式动物研究所。
1．1．2 主要试剂
甲醛、无水乙醇购于Sigma公司，异戊醇购于上海凌峰化学试剂有限公司，异丙醇购于国药集团化学试剂有限公司，琼脂糖、中性树胶购于上海生工生物工程技术有限公司，苏木素染色液、福尔马林固定液购于无锡市江原实业技贸总公司，浸蜡脱蜡透明液购于安徽雷根生物技术有限公司，环保透明剂购于珠海贝索生物技术有限公司，DAB试剂盒购于vector公司，PLZF的抗体Rabbit poly IgG(sc22839)与AR的抗体Rabbit monoclonal IgG(abl33273)分别购于Santa Cruz和Abcam公司。

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