精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)位于睾丸生精小管靠近基底膜的部位，是哺乳动物体内唯一能将遗传信息传递给下一代的成体干细胞。它既能通过自我更新维持自身数量的稳定，又能在体内定向分化形成精子。上皮型钙黏蛋白(E-cadherin，CDH1)是一种跨膜糖蛋白，普遍存在于各种上皮细胞，对维持组织结构形态和完整性有重要作用，同时与细胞增殖、分化也密切相关。KIT是干细胞因子(SCF)的受体，它与SSCs分化关系密切，其表达水平可反应SSCs的分化程度。因此，本实验首先构建生殖系特异性E-cadherin基因敲除小鼠，并且利用PCR和Western blot进行鉴定；然后通过IHC检测基因敲除小鼠睾丸内KIT的表达，统计分析KIT阳性生殖细胞数量。实验结果表明，小鼠睾丸中E-cadherin基因缺失后，KIT阳性生殖细胞数量增加，初步证实E-cadherin对SSCs分化具有负调控的作用。本研究将为小鼠精原干细胞分子调控机制研究提供帮助。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1 材料 4
1.2 方法 5
1.2.1 小鼠合笼5
1.2.2 小鼠尾巴DNA提取5
1.2.3 小鼠基因型鉴定5
1.2.4 Western blot5
1.2.5石蜡切片制备6
1.2.6免疫组化7
1.2.7数据统计和处理7
2 结果与分析7
2.1 PCR鉴定基因型7
2.2 Western blot验证基因型8
2.3 免疫组化检测KIT9
2.4 统计分析KIT阳性细胞数量的变化10
3 讨论 10
致谢11
参考文献11
图1 PCR鉴定小鼠基因型8
图2 EcadherinL/L;DDX4 Cre小鼠和对照组小鼠睾丸中Ecadherin蛋白表达9
图3对照组和基因敲除小鼠睾丸中IHC检测KIT9
图4 Eca *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
dherin基因敲除后KIT阳性生殖细胞数量分析10
生殖系特异性Ecadherin敲除对小鼠睾丸KIT+精原细胞群的影响研究
引言
精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是雄性哺乳动物体内的生殖干细胞，位于曲细精管基膜，由原始生殖细胞分化而来[1]。根据精原细胞在小鼠曲细精管基膜上的排列特征，可将A型精原细胞分成单个型(As)，对称型(Apr)和链状排列型(Aal)，一般认为As细胞是小鼠SSCs[2]。SSCs具有两大特点：自我更新和分化，一方面SSCs通过自我更新维持自身数量的恒定，另一方面可以分化产生大量精子，维持生殖力。在睾丸内，SSCs存在于一个被称为niche的特殊微环境中，niche由精原细胞、支持细胞、管周肌样细胞、各种生长因子及其他活性分子构成[3]。有文献报道，微环境对SSCs的调节可分为两种途径：一种是外源性调节，主要是通过机体其他组织或器官产生活性物质进入内分泌系统运输到睾丸，作用于微环境；另一种是内源性调节，即自身微环境中的各类因素直接或间接接影响SSCs的增殖、分化、代谢及功能活动[4]。
上皮型钙黏蛋白(Ecadherin，CDH1)是钙粘蛋白家族中的一员，是一种钙离子依赖性跨膜糖蛋白，普遍存在于各种上皮细胞中[5]，它主要影响细胞间的粘附功能，对维持上皮细胞的组织结构完整性与细胞间的稳态都起着至关重要的作用，也是细胞微环境的重要组成部分之一[6]。其胞内结构域包含1个高磷酸化的区域，与连环蛋白(catenin)的结合密切相关，进而会影响Ecadherin的功能。目前，有大量研究表明，Ecadherin是一种抑癌因子，其对肿瘤细胞的迁移和增殖有抑制作用，肿瘤细胞中Ecadherin的低表达是肿瘤的侵袭和转移的重要原因之一[7,8]。除此之外，有研究表明其与细胞的增殖、分化也密切相关。有研究发现，Ecadherin在小鼠未分化的A型精原细胞中有特异性表达[9,10]，参与调控SSCs自我更新[11]，翟源心等报道Ecadherin可以促进奶山羊SSCs自我更新[12]。
KIT是酪氨酸激酶受体蛋白家族的重要成员之一，是干细胞因子(SCF)的受体，大量研究表明，KIT表达与精原细胞分化关系密切[13]。当精原干细胞分化受到抑制时，KIT表达显著降低；而当精原干细胞分化增强时，KIT的表达升高。KIT目前是精原干细胞分化的特异性标志物，其表达水平可反应精原干细胞分化活动的强弱[14]。
Cre重组酶是大肠杆菌内一种由Cre基因编码的能特异性识别LoxP序列的酶[15]，它可以根据两个Loxp序列的位置和关系介导不同的特异性重组反应，若两个Loxp序列位于同一条DNA且方向相同时，Cre重组酶可将两个Loxp序列间的DNA切除，达到基因敲除的效果；若两个Loxp序列位于同一条DNA且方向相反时，Cre重组酶可将两个Loxp序列间的DNA倒转；若两个Loxp序列位于不同DNA链上时，Cre重组酶可将Loxp序列间的DNA交换或染色体易位[16]。Ddx4 Cre是睾丸特异性表达的Cre基因，本研究将采用Cre/LoxP重组酶系统构建睾丸中特异性Ecadherin基因敲除小鼠，用已经得到的Ecadherin flox基因小鼠与睾丸特异性表达Ddx4 Cre基因小鼠合笼，得到雄性杂合子的Ecadherin flox基因小鼠，然后再与雌性Ecadherin flox基因小鼠合笼，得到的子代通过PCR进行基因型鉴定筛选出Ecadherin基因敲除小鼠，并采用Western blot进行进一步验证。最后通过免疫组化检测Ecadherin基因敲除小鼠睾丸中KIT，统计分析Ecadherin基因敲除前后KIT阳性生殖细胞数量的变化，初步探索Ecadherin基因与KIT阳性生殖细胞之间的关系，从而初步分析Ecadherin基因对小鼠精原干细胞命运的影响。

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