在雌性动物生殖过程中，表观遗传学调控因子circRNA对基因的转录调控发挥着重要作用，这引起了学界广泛关注并取得了一定的研究进展。circINHBB为抑制素（Inhibin，INH）家族基因INHBB作为宿主基因而产生的circRNA分子。抑制素属于转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)超家族成员，该家族成员主要参与调节体内各种细胞生长和分化过程，其在卵泡闭锁过程中的表达情况及调控机制研究具有较强应用前景。本实验拟从猪卵巢中完整分离健康、早期闭锁的3-5mm有腔卵泡，通过RT-qPCR检测在卵泡闭锁过程中的表达模式和特征，探索其在猪卵泡闭锁过程中的作用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.1.1实验动物2
1.1.2主要与仪器2
1.2实验方法 2
1.2.1猪卵泡分离和分类2
1.2.2单个卵泡总RNA的提取3
1.2.3反转录获得cDNA3
1.2.4引物设计3
1.2.5聚合酶链式反应（PCR）4
1.2.6定量PCR产物的琼脂糖凝胶电泳4
1.2.7 PCR产物测序4
1.2.8RTqPCR4
1．2．9统计分析5
2结果与分析5
2.1circRNA鉴定5
2.2circINHBB在猪健康和闭锁卵泡中的差异性表达6
3讨论 7
3.1研究意义 7
3.2影响实验成功的因素 7
3.3卵泡闭锁程度的分类方法 7
3.4总结 8
致谢8
参考文献9
图1 circINHBB的模型图 5 图2 聚合酶链反应扩增的结果6
图3 比对的结果6
图4 circINHBB 首尾链接序列测序峰图6
图5 卵泡外观形态判定7
图6 circIN *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
HBB在猪健康和闭锁卵泡中RTqPCR检测结果7
表1 引物信息4
环状circINHBB在猪卵泡闭锁过程中表达特征分析
引言
引言
在研究中，人们发现表观遗传学调控因子circRNA在基因的转录调控中发挥着非常重要的作用，抑制素对卵泡发育影响极大。环状RNA（circRNA）是一种环状内源性RNA分子[1]，这种RNA分子是由真核生物中的前体mRNA的反向剪接所产生的，其分布非常广泛，结构非常稳定，具有细胞和组织特异性[2]。circRNA在生物体内用很多种方式参与生物学调控过程以及疾病的发生发展。目前发现的功能模式包含竞争性内源性RNA作用、与蛋白质互作、翻译成蛋白质以及顺式调控亲本基因的转录等[3]。在查阅文献后发现，一般情况下抑制素可以分为下列两种，一种是主要由α亚单位和β亚单位中的βA形式结合而成的抑制素，称为抑制素A (INHA,αβA)，另外一种是主要由α亚单位和β亚单位中的αβ结合形成的抑制素，我们称为抑制素B ( INHB,αβB)，要想使抑制素具有生物活性，[4]必须使得两个亚单位形成二聚体。通过相关翻阅相关资料，了解到，在卵泡发育的早期颗粒细胞已经开始分泌抑制素，卵泡分泌的抑制素在募集后比例显著上升。在此课题中，我们所研究的抑制素为抑制素B (Inhibin ,INHBB)，这种抑制素属于以上所提到的第二种抑制素，即由a亚单位和βB亚单位通过二硫键连接形成的抑制素，其本质是异质二聚体糖蛋白激素，雌性卵巢颗粒细胞和雄性睾丸支持细胞是抑制素的主要分泌细胞。抑制素通过反馈抑制FSH的合成和分泌,从而进一步影响动物的相关繁殖能力,将动物的繁殖力控制一定的水平上水平。应用抑制素作为免疫原,通过主动或被动免疫的方法,调控动物的排卵率和繁殖力,是一项提高动物繁殖性能的[5]新技术。circINHBB为抑制素（Inhibin，INH）家族基因INHBB作为宿主基因而产生的circRNA分子。本实验从猪卵巢中完整分离健康、早期闭锁的35mm有腔卵泡，通过RTqPCR检测在卵泡闭锁过程中的表达模式和特征，探索circINHBB在猪卵泡闭锁过程中的作用。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 实验动物
我们采用大型养猪厂的商品猪卵巢用于实验,在屠宰后几分钟之内，收集猪的两侧侧卵巢,将卵巢放置在37℃的添加抗生素的生理盐水中，并且尽快送往实验室，用以进行之后的实验，也要保证卵巢的新鲜度。
1．1．2 主要与仪器
PBS缓冲液，生理盐水（0.9%的氯化钠水溶液），Trizol，氯仿，异丙醇，乙醇，RNase试剂，反转录引物（Oligo dT18），Taq DNA聚合酶，SYBR Premix Ex TaqTMDNA聚合酶， Marker，青霉素，链霉素，扩增引物，TBE溶液
体视显微镜，细胞计数板，超净工作台，可调式微量移液器，高压灭菌锅，微波炉，小型离心机，电子天平，超低温冰箱（温度可以低至80℃），梯度PCR仪，高速冷冻离心机，实时荧光定量PCR仪，DYYIII2电泳仪，电泳凝胶成像仪
1．2 实验方法
1．2．1 猪卵泡分离与分类
在屠宰场中采集商品肉猪双侧卵巢，将卵巢放置在37℃的添加抗生素的生理盐水中，并且尽快送往实验室，以方便后续的实验进行。用眼科剪将已经用PBS清洗过后的卵巢剪开，然后剥离单个卵泡，这一步用镊子在体视镜下完成，在剥离出的卵泡中选取大小合适直径为3~5mm的卵泡。根据文献内容在体显镜下通过观察卵泡的外部特征对卵泡进行初步分类，壁层颗粒细胞的分布、卵泡液的清澈程度，是否有沉淀等分为健康卵泡和早期闭锁卵泡[6]。
将初步分类后的卵泡放入自制的收集管( 管底部有适度间隙，可通过卵泡液但过滤卵泡组织) 中撕破，取来1.5 mL 离心管，将收集管放到里面，然后进行离心，离心后卵泡液和卵泡腔内颗粒细胞沉入离心管底部，而卵泡壁和壁层颗粒细胞依然留在收集管中。离心管继续离心5s，将离心管底部的颗粒细胞吹打均匀，使其均匀分布在液体中，然后吸取2μL颗粒细胞悬液放入一个离心管中，加入18μLPBS试剂，继续吹打均匀，之后用血球计数器计数。

原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/dwyx/562413.html