本课题针对生产上仔猪腹泻严重的问题，研究天然定植在肠道的沙门氏菌噬菌体在肠道的粘附能力和粘附特性，以及粘附上的沙门氏菌噬菌体抵抗沙门氏菌侵袭肠道保护肠黏膜的作用效果，为噬菌体成为一种新型抗生素替代品以及仔猪腹泻预防措施的制订提供新思路。本试验利用前期分离到的三株猪霍乱沙门氏菌噬菌体S19cd、Lv5cd与L6jm，体外研究了这三株噬菌体在MDCK，Caco2和IPEC-1细胞上的黏附能力。发现三株噬菌体黏附细胞能力存在差异，但在产黏液细胞上（IPEC和Caco2）的粘附能力显著高于不产黏液（MDCK）的细胞，且三株噬菌体黏附细胞均属于松散粘附，粘附数量的多少与初始接种的噬菌体浓度成正比。细胞保护性试验上我们发现仅S19cd、Lv5cd粘附在细胞上的噬菌体对沙门氏菌的侵袭有保护作用，能显著降低沙门氏菌的数量。
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言4
1材料与方法5
1.1材料 5
1.1.1菌株与细胞5
1.1.2主要仪器与试剂5
1.2步骤与方法 5
1.2.1常规试验方法5
1.2.1.1培养基配置6
1.2.1.2细胞培养6
1.2.1.3噬菌体扩增6
1.2.2噬菌体黏附特性6
1.2.2.1细胞是否产生黏液与噬菌体粘附数量关系探究6
1.2.2.2噬菌体黏附数量与初始接入数量关系探究6
1.2.2.3噬菌体种类与粘附数量关系探究6
1.2.3抑菌作用7
1.2.3.1沙门氏菌的培养7
1.2.3.2抑菌效果7
2结果与分析7
2.1黏附特性7
2.1.1噬菌体粘附数量与细胞是否产黏液关联性7
2.1.2噬菌体浓度梯度依赖性7
2.1.3噬菌体粘附数量与自身特性相关性8
2.2抑菌作用9
2.2.1噬菌体体外抑菌效果测定9
2.2.2接入相同浓度噬菌体时抑菌效果测定11
2.2.3相同粘附浓度S19cd、 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
Lv5cm抑菌效果测定12
3讨论 13
3.1黏附特性13
3.1.1噬菌体粘附数量与细胞是否产黏液关联性13
3.1.2噬菌体浓度梯度依赖性13
3.1.3噬菌体粘附数量与噬菌体自身特性相关性13
3.1.4噬菌体粘附的紧密性13
3.2沙门氏菌噬菌体的抑菌能力14
3.3噬菌体应用的研究进展及局限性14
4总结 15
致谢15
参考文献15
猪肠道沙门氏菌噬菌体在肠道黏膜的粘附特性和对肠道黏膜保护作用研究
引言
引言:沙门氏菌是一种常见的致病菌,可分为多种类型。其致病因素主要是侵袭力和内毒素，个别菌株还能产生肠毒素。有毒株借助菌毛吸附于小肠粘膜上皮细胞并穿过上皮细胞层至黏膜下组织。另外沙门菌有较强的内毒素，可引起机体发热，白细胞减少和微循环功能障碍等多种毒性反应。个别沙门氏菌如可产生肠毒素引起水样腹泻。一般情况下,畜禽肠道带菌率比较高,当动物因体弱、疲劳或营养不良导致抵抗力下降时,肠道中的沙门氏菌即可经肠系膜淋巴结和淋巴组织进入血液，引起全身感染,严重的甚至会导致畜禽死亡[1]。
仔猪由于消化器官不发达、消化功能不完善、体温调节机能不健全、抗寒能力差、免疫抵抗力低等，易受外界因素侵袭，患病率高。腹泻是仔猪常发疾病，也是引起初生仔猪至断奶保育仔猪死亡的主要原因[2]，其中，猪霍乱沙门氏菌是引起断奶仔猪腹泻的主要病原。临床感染一般可分为急性、亚急性、慢性三种类型，病情较急时，临床上多表现为慢性坏死性肠炎、顽固性下痢、急性败血症等，常引起较高死亡率，其中败血型病死率达90%，慢性型病死率达25%~50%。病情较轻时也会导致坏死性肠炎,阻碍仔猪的生长发育。且该病的发生与季节无太大关系,多与猪瘟混合感染,当治疗不及，造成其它疾病并发或继发感染时,死亡率会更高，给我国养猪业带来巨大经济损失[3]。国内外学者对猪场的沙门氏菌调查显示，猪群粪便中沙门氏菌的分离率达4% 17%[4,5]，而腹泻粪便样品中检出率达18%35%[6,7]，并且调查发现断奶阶段粪样中沙门氏菌的分离率显著高于生长或哺乳阶段[8]。我国是猪肉生产大国，沙门氏菌感染疾病具有密集多发的特点，且近几年，由于抗生素药物的滥用，各种沙门氏菌菌株耐药性逐渐增强，寻找新型替代药剂成为亟待解决的问题[9]。
噬菌体是一类可以感染细菌的病毒，存在于任何有细菌的地方，影响着各种生态系统中细菌的种类和数量。人和动物的肠道病毒组测序结果表明噬菌体是肠道病毒群的主要组成[10,11]。由于噬菌体与细菌存在“捕食被捕食”关系，噬菌体的种类和数量直接影响着肠道的生理状态或微生物区系[12]，因此近几年，肠道内噬菌体和微生物菌群之间的关系受到越来越多的关注。
黏膜屏障是机体的第一道免疫防线，也是一些病原微生物入侵机体的门户，因此黏膜屏障抵抗细菌的能力对机体的健康至关重要。肠道在消化吸收的同时，也会与毒素、致病菌等抗原物质接触[13,14]。健康的肠道菌群能够起到保护肠道黏膜的作用，起到调节机体免疫力、促进宿主代谢、预防炎症等功能。Barr等 2013年研究首次发现，在人口腔和小鼠肠道黏膜表面的噬菌体的数量均要多于黏膜周围环境的，并且粘附上的噬菌体能通过裂解细菌的方式显著减少细菌对上皮细胞的粘附和侵袭，从而保护上皮细胞免受细菌的感染[15]。目前，也有文献报道了给猪饲喂沙门氏菌噬菌体可以减轻由致病性沙门氏菌攻毒引起的腹泻，并减少粪中沙门氏菌的数量[16]。还有文献报道了在猪上，日粮中添加噬菌体鸡尾酒（多种噬菌体混合，包括沙门氏菌噬菌体，葡萄球噬菌体，大肠杆菌噬菌体等）能有效促进肠道健康[17]。
但目前研究中所用的噬菌体均是从环境或污水中分离到的，几天后噬菌体滴度就开始下降，噬菌体很少能定植体内[18,19]，因此，本课题本项目针对生产上仔猪腹泻严重的问题，以幼龄阶段肠道噬菌体对肠道细菌存在显著的“捕食关系”为切入点，拟首先研究从猪肠道分离到的沙门氏菌噬菌体即天然定植在肠道的沙门氏菌噬菌体在肠道的黏附能力和黏附特性，并进一步研究黏附上的沙门氏菌噬菌体抵抗沙门氏菌侵袭肠道保护肠黏膜的作用效果，从而对仔猪肠道黏膜上存在大量的沙门氏菌噬菌体，是否能更高效保护肠上皮细胞抵抗沙门氏菌的粘附侵袭的问题进行进一步探究，为噬菌体成为一种新型抗生素替代品以及仔猪腹泻预防措施的制订提供新思路。

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