成功的猪卵母细胞冷冻保存为农业，动物科学和人体医学研究领域提供了一个有前景的视角，也对于增加高质量遗传资源的高效利用，阻止疾病通过动物传播以及降低猪的运输成本具有重要意义。本实验的目的是通过比较猪GV期卵母细胞和MII期卵母细胞Cryotop冷冻复苏的存活率，选择猪卵母细胞玻璃化冷冻的最佳时期，并且判断猪GV期卵母细胞的颗粒细胞对冷冻存活率和成熟率的影响。结果表明，带有颗粒细胞的猪GV期卵母细胞解冻后的存活率显著高于猪MII期卵母细胞（P<0.05），二者均显著高于裸卵猪GV期细胞（P<0.01），同时带有颗粒细胞的猪GV期卵母细胞的成熟率也显著高于裸卵猪GV期卵母细胞，但均明显低于对照组（P<0.01）。由此可见，带颗粒的GV期卵母细胞冷冻存活率较MII期卵母细胞高，保留颗粒细胞可以减少冷冻对猪GV期卵母细胞的伤害。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 主要实验试剂 2
1.2 方法 3
1.2.1 卵母细胞来源3
1.2.2 冷冻与复苏3
1.2.3 实验设计3
1.2.3.1 猪COCs期和MII期卵母细胞对Cryotop冷冻存活率的影响3
1.2.3.2 实验设计路线3
1.2.4 卵母细胞的存活判定4
1.2.5 统计分析4
2 结果4
2.1 操作细节对冷冻成活的影响4
2.2猪COCs期和MII期卵母细胞的Cryotop玻璃化冷冻后效果4
2.3卵子冷冻复苏后死活的判断对效果的影响4
3 讨论5
致谢7
参考文献7
猪卵母细胞玻璃化冷冻的优化
引言
胚胎的冷冻保存是胚胎生物技术的重要组成部分，不仅可以为体外受精、核移植、胚胎移植等胚胎工程技术提供具有发育能力的材料，也可以与精液冷冻保存一起建立种质资源库，为有价值的雌性个体和珍稀濒危野生动物的遗传资源的长期保存提供新的途径，从而不受时间和空间的限制[1]。猪卵母细胞的玻璃化冷冻保存作为保 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
护动物遗传资源的主要手段之一还存在不少缺陷。与其他物种卵母细胞的玻璃化冷冻相比，猪卵母细胞对低温特别敏感，猪卵母细胞中的高脂质含量普遍被认为主要原因之一[2]。
影响卵母细胞冷冻效果的因素众多，其中一个主要因素就是卵母细胞的发育阶段。多数研究结果表明卵母细胞对冷冻的耐受性随发育的增加而增加，MII期卵母细胞的冷冻效果明显优于GV和 GVBD卵母细胞。GV期卵母细胞MII期卵母细胞因生理结构不同从而受到的冷冻伤害程度也不同。卵母细胞在从GV期到MII期的成熟发育过程中，要发生一系列的变化。GV期卵母细胞的冷冻保存，有可能导致细胞器、卵黄膜和外围颗粒细胞之间联系的中断；而且经过超低温冷冻卵子的超微结构（微绒毛，微管等）受到严重损害，GV期卵子解冻复苏后继续体外成熟将受到直接影响，从而进一步影响卵子的受精与胚胎的后期发育。但MII期成熟卵母细胞脂滴进一步储存，胞质体积进一步略大，含水分多等原因，因此，MII期卵在冷冻复苏过程中极易受到细胞内冰晶形成所造成的损伤。另外，无论是GV期还是MII期卵的微管系统对温度的变化都非常敏感，在冷冻复苏过程中容易发生解聚[3]。另外，卵子在成熟过程中细胞膜的对水分和冷冻保护剂的通透性发生变化，可能更有利于接受冷冻保护剂的渗透，从而达到更有利于冷冻的保护浓度 [4]。
但相反的，也有人认为GV期卵母细胞比MII期卵母细胞更具冷冻耐受性[4][5]，其原因则可能冷冻损伤对细胞骨架的影响比较大，但是由于GV期卵母细胞没有丰富的细胞器，如染色体和纺锤体，而MII期的成熟卵母细胞具有丰富的骨架系统，如以控制决定着细胞的分裂和染色体的分布、影响细胞发育的肌动蛋白为基础的微丝和微管比较丰富，因此冷冻损伤对MII期卵母细胞的发育造成不可逆影响。有研究证实，冷冻导致的猪MII期卵母细胞微丝和微管异常变化，在复苏后将难以恢复。但GV期卵母细胞经冷冻复苏、体外成熟后却不会出现明显的这种细胞骨架结构受损情况[6]。可见猪GV期卵母细胞冷冻后的存活率虽然较低，但能正常完成减数分裂恢复，其体外受精能力也没有受到影响，可以产生高质量的囊胚。同时随着时间的推进，猪GV期卵母细胞的冷冻保存技术不断优化，其存活率也会大幅提高，使此阶段的冷冻保存具有更大的潜力[7]。
另一方面在冷冻GV 期卵母细胞时是否应该保留颗粒细胞，目前尚存在争议。既有人认为GV期卵子的冷冻效果并不受保留颗粒细胞与否的影响[8]。而Wolvekamp [8]等证实保留颗粒细胞可以促进冷冻复苏后的卵母细胞的生长发育。卵丘卵母细胞上介导卵母细胞和卵丘细胞的缝隙连接非常重要，既具有通讯功能又具有物质交流能力，两者之间的缝隙连接不仅为卵母细胞提供大量的营养物质，还会影响卵母细胞的减数分裂、机能的恢复和其冷冻复苏后的体外成熟。因此，有些研究者认为当对裸露的没有卵丘颗粒细胞（被去掉）的卵母细胞进行冷冻后，GV期卵母细胞由于缺少卵丘颗粒细胞，其体外成熟的效率与质量和受精后胚胎的发育能力受到显著影响[5]。但是有些研究者却认为卵母细胞包裹的透明带糖蛋白和颗粒细胞层不仅减缓了冷冻保护剂渗透速率，还可能会导致细胞内冷冻保护剂分布不均，从而在冷冻过程中未能达到冷冻保护剂所必须的浓度，不能高效的起到该有的冷冻保护作用[5]。目前通过Cryotop玻璃化冷冻法分析猪MII期及颗粒细胞对猪 GV 期卵母细胞的冷冻效果的影响的研究比较少，本实验通过比较猪带有卵丘颗粒细胞的GV期卵母细胞和MII期卵母细胞Cryotop冷冻复苏的存活率和成熟率，选择猪卵母细胞玻璃化冷冻的最佳时期。
1 材料与方法
1.1 主要实验试剂
除非另有说明，否则本研究的所有化学品均购自Sigma公司。
成熟液（IVM）： TCM199中添加10%猪卵泡液、0.91mmol/L丙酮酸钠、0.57mmol/L半胱氨酸、3.05 mmol/L 葡萄糖、10ng /mL EGF 、0.01U/mLFSH 和LH。
冷冻基础液（T20）：T0+20%FBS

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