:SMAD4基因作为TGF-β/SMAD信号通路中唯一的共介导型转录因子，主要通过对下游卵泡发育相关基因的转录调控，在卵泡发育的过程中发挥着重要的作用。长链非编码RNAs（lncRNAs）能够通过调控细胞的增殖、分化、周期以及凋亡，进而参与到各个生物进程中去。但目前关于SMAD4调控lncRNAs的研究还非常有限。本文利用实验室前期的SMAD4敲减后猪卵巢颗粒细胞转录组数据和猪健康、闭锁卵泡转录组数据进行联合分析，鉴定受SMAD4调控并在猪卵泡闭锁过程中差异表达长链非编码RNAs；利用特异性引物对目标长链非编码RNA的启动子区进行PCR扩增；通过双酶切法构建含有候选lncRNA基因的启动子区的pGL3报告载体；利用荧光素酶活性分析对目标长链非编码RNA基因的启动子区进行验证；通过在卵巢颗粒细胞中转染SMAD4基因过表达质粒以及小干扰RNA, 分析SMAD4基因对目标长链非编码RNA启动子活性和表达水平的调控。结果鉴定出10个在2个转录组数据中均差异表达的长链非编码RNA；获得的猪LOC102157709启动子序列，长度为1013 bp；在LOC102157709启动子区上发现HOXA9、FOXO1、AR等多个转录因子结合位点，同时也发现了2个SMAD4结合位点（SBE）； 荧光素酶活性分析发现这个片段具有转录活性（P<0.01），为潜在的LOC102157709启动子区；过表达SMAD4显著下调了LOC102157709的启动子活性（P<0.05），而敲减SMAD4对LOC102157709的启动子活性并没有显著影响；同时，荧光定量PCR结果显示，在猪卵巢颗粒细胞中过表达SMAD4基因能够显著抑制LOC102157709的表达水平（P<0.05），而敲减SMAD4能够极显著促进LOC102157709的表达水平（P<0.01）。总之，本文证实SMAD4是猪卵巢颗粒细胞中LOC102157709基因的转录抑制因子。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 2
引言2
1材料与方法3
1.1试验样品 3
1.2材料与试剂 3
1.3主要仪器 3
1.4实验方法3
1.4.1组学整合分 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
析 3
1.4.2目的序列的扩增 3
1.4.3PCR产物的回收和纯化4
1.4.4启动子载体的构建4
1.4.5颗粒细胞的培养4
1.4.6质粒以及载体的转染5
1.4.7荧光素酶活性的检测5
1.4.8细胞中RNA的提取5
1.4.9反转录进行cDNA的合成5
1.4.10荧光定量PCR5
1.4.11数据分析6
2结果与分析6
2.1 2种转录组测序中差异长链非编码RNAs联合分析 6
2.2 LOC102157709基因组定位与启动区序列分析6
2.3LOC102157709启动子区的扩增与序列分析7
2.4 LOC102157709启动子区报告载体的构建与荧光素酶活性的检测9
2.5 SMAD4基因对LOC102157709启动子区活性的影响 9
2.6 SMAD4基因对LOC102157709表达水平的影响 10
3讨论 10
致谢 12
参考文献 12
SMAD4调控猪卵巢颗粒细胞中LOC102157709表达的机制

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