组蛋白去乙酰化酶(HDACs)参与了一系列广泛的生物学过程。然而，HDACs的成员之一，HDAC3，在猪卵母细胞成熟中的作用仍不清楚。在本研究中，我们使用HDAC3的一种特异性的抑制剂RGFP966来研究HDAC3对猪卵母细胞成熟的影响。我们发现，HDAC3活性的抑制不仅可以影响卵丘细胞的扩张，还可以阻止卵母细胞减数分裂的进程。有趣的是，当正常卵母细胞进入减数分裂期时，HDAC3呈纺锤体样分布，但是激光共聚焦扫描显微镜显示，暴露于抑制剂RGFP966的中期卵母细胞却呈现高频率的纺锤体组装缺陷和染色体排列异常的现象。这些结果显示，抑制HDAC3活性可以影响猪卵母细胞的成熟过程和减数分裂装置的装配，这表明HDAC3蛋白是维持猪卵母细胞成熟的一个重要因素。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1实验材料4
1.1试验动物 4
1.2实验仪器4
1.3抗体和试剂5
1.3.1抗体5
1.3.2主要试剂5
1.4试剂配制5
2实验方法5
2.1猪卵母细胞采集前的准备5
2.2猪卵母细胞的获取及培养 5
2.3免疫荧光染色和共聚焦显微镜检测6
2.4数据分析6
3结果与分析6
3.1 HDAC3在猪卵母细胞成熟过程中的分布6
3.2 HDAC3被RGFP966抑制后对猪卵母细胞成熟进程的影响7
3.3HDAC3抑制后对猪卵母细胞的纺锤体形态和染色体组织的影响8
4讨论9
致谢9
参考文献10
HDAC3在猪卵母细胞成熟中的作用
引言
卵母细胞成熟是胚胎生产的上游环节。建立高效稳定的卵母细胞成熟体系便可以获得优质的第Ⅱ次减数分裂中期卵母细胞[1]，同时提高胎儿出生率，从而可为研究发育机理、改良品种、培育抗病猪种等做出巨大贡献。因此，研究猪卵母细胞的成熟机制是有必要的。
哺乳动物的卵母细胞成熟必须经历减数分裂过程。在减数分裂过程中，卵母细胞分步骤的逐 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
渐获得向胚胎发育的能力。具体过程是，在动物出生时进入减数分裂Ⅰ期，在性成熟时主要在LH（促黄体素）和FSH（促卵泡素）的协同作用下卵泡排出、生发泡破裂、卵丘细胞扩散且排出第一极体，之后便阻滞在减数分裂Ⅱ中期。由于我们一般认为生发泡破裂(germinal vesicle breakdown, GVBD)是卵母细胞向成熟方向发育的标志[2]，所以当卵母细胞到达减数分裂Ⅱ中期时，代表卵母细胞已成熟。其成熟包括卵母细胞核成熟和胞质成熟这两部分。
其中，染色体分离是卵母细胞核成熟的主要表现，而细胞器的重新分配、卵母细胞成熟、受精和早期胚胎发育所需的蛋白质和转录因子的储存则是质成熟的主要表现[3]。正常猪卵母细胞的染色体发育过程如下：2～17 h GV期时，52.38%～88.30%卵母细胞中的染色质呈丝、絮、粗块状，核膜核仁完整；22h GVBD～preMⅠ期时，63.25%卵母细胞中的染色体浓缩，核膜破裂；27h MⅠ期时，42.25%卵母细胞中的染色单体清晰可见，且俯看呈圆形，排列在赤道板上；32h AⅠ期时，29.90%卵母细胞比例最多；37h TⅠ期时，卵母细胞中的染色体在纺锤体牵引下向两极移动，隐约可见纺锤体；42h MⅡ期时， 72.81%的卵母细胞中的染色体已完全分开，呈两团粗块状[3]。当然，这整个过程的实现依赖于如MPF和MAPK等成熟因子的调控[4]。随着卵母细胞的核成熟，胞质也会发生许多与成熟有关的变化，例如胞质细胞器线粒体、核糖体、高尔基体、内质网的重新分布，细胞骨架如微管蛋白等的形成与运动，这些都是为卵母细胞激活、原核形成和着床前胚胎发育而进行的准备工作[5]。此外，在染色体分离或纺锤体拉伸的过程中，可发现大量的微管蛋白，或富集在染色体周围，或位于两团染色体之间形成一个巨大的锥形结构。已有研究表明，在卵母细胞减数分裂过程中，细胞质中的细胞骨架结构系统具有带动细胞核中的染色体和纺锤体运动的作用。通过这种将细胞质内容物及卵母细胞后期发育所需旳遗传信息留在卵母细胞内部的方式，细胞质参与了卵母细胞的成熟过程[3]。因此我们可以看出，在卵母细胞成熟的过程中，细胞质和细胞核的成熟既相互独立又相互依存。由于受精后正常胚胎发育主要依赖于卵母细胞的核成熟和胞质成熟[6]，尤其对于核移植的卵母细胞而言，供体核实现彻底的再程序化及重构胚维持正常的分裂发育是由胞质的成熟直接决定的 [7]，所以若在体外成熟的猪卵母细胞的核成熟和质成熟不完善就会造成卵母细胞成熟质量不高进而影响受精后正常胚胎发育[8]。
HDACs是一组组蛋白去乙酰化酶，其作用是去除组蛋白N端尾部赖氨酸残基上的动态的、可逆的乙酰基[9，10]。由于一方面基因转录激活与抑制分别由组蛋白乙酰化与去乙酰化影响[11]；另一方面在真核细胞中，核小体的动态变化、染色质的动态变化、转录因子的介入由组蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶的相互作用影响 [12]。因此基于以上两方面, HDACs被认为具有抑制染色质活化与基因转录激活的重要作用[13]。迄今为止，基于其酵母类似物的同源性，已经在哺乳动物中鉴定出18种HDACs，包括I类(HDAC1、2、3和8)、II类(HDAC4、5、6、7、9和10)、sirtuin III类(SIRT17)和IV类(HDAC11)。HDACs已被报道在多种生物事件中发挥作用。例如, 由于细胞增殖的明显缺陷，HDAC1导致胚胎死亡(Pasricha et al., 2017)；HDAC2和HDAC4似乎是稳定成熟卵母细胞基因组的关键因素(Kageyama,Nagata,& Aok,2006；Ma & Schultz,2013)。目前已存在的关于HDAC3的研究如下：WeiL等人发现在小鼠胶质瘤模型中，HDAC3具有成瘤能力且使血管生成增多，从而导致带瘤小鼠的生存期缩短[15]；曹俊等人通过以果蝇翅膀成虫盘(wing disc)为模型，发现HDAC3可以选择性地调控形态发生素下游靶基因的转录；在肝脏的代谢平衡和肝癌的形成中，HDAC3能够抑制酯类合成、促进糖异生作用；王小洁等人在探讨HDAC3在小鼠胚胎肺发育中的作用过程中，发现HDAC3基因可能作为Wnt信号的上游调节因子，在肺发育晚期阶段通过调节Wnt信号通路活性来实现对胚胎肺发育功能的调控；王丹秋等人在老龄小鼠卵母细胞发育过程中发现HDAC3 mRNA表达量的突然增加可能与其减数分裂中染色质结构异常密切相关，其中机制还有待实验进一步研究。另外发现，在组蛋白的去乙酰化过程中，HDAC3发挥生物学作用的前提是HDAC3被TCP1换装复合体合适折叠，且与核受体辅阻遏子形成一个活性酶复合物[14]。例如，HDAC3与NCoＲ/SMＲT 的复合物通过两种途径抑制转录：第一种是组蛋白去乙酰化减少了bromo结构域辅激活剂的招募，具体指染色质相关蛋白及特异结合在乙酰基赖氨酸亚基上提高转录活性的组蛋白HAT[16，17] ；第二种是乙酰基的移除可以增加组蛋白末端与带负电的DNA主链的亲和力，从而导致染色体构成关闭难以进行转录。但是目前，对于HDAC3在猪卵母细胞方面的影响是有待更深层次地研究的。

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