本研究以NSs蛋白为包被抗原，利用先前制备好的NSs蛋白单克隆抗体，确立裂谷热病毒阻断ELISA抗体测定手段。优化环境为抗原包被的浓度需要达到2µg/mL，4℃包被过夜，用含0.5% BSA的PBST 37℃ 封闭2h；待检血清按120稀释，37 ℃作用30min；酶标单抗按11000稀释，37℃作用30min；TMB底物显色时间为15min。判定标准如下当阻断比例高于38.82 %这一数值时为阳性，低于29.21%这一数值是为阴性，数值在两数字间为可疑。用使用这一测定手段测定山羊副流感病毒3型、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、绵羊肺炎支原体、RVFV N蛋白阳性血清测试结果表明均为阴性，这种该检测手段具有比较好的特异程度。批间、批内重复试验的变异比例都小于10%。因此，阻断ELISA抗体检测裂谷热病毒NSs蛋白的方法成立。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1.材料与方法2
1.1材料2
1.1.1主要试剂2
1.1.2主要仪器2
1.2方法2
1.2.1 NSs蛋白的纯化和蛋白浓度的检测2
1.2.2 RVFV NSs蛋白阻断ELISA抗体检测方法的建立和反应条件2
1.2.2.1抗原包被浓度及酶标抗体最佳稀释度的确定2
1.2.2.2待检血清最佳稀释度的筛选2
1.2.2.3血清最佳孵育时间的选择2
1.2.2.4酶标单抗最佳作用时间的筛选3
1.2.2.5最佳显色时间的筛选3
1.2.2.6 Outoff确定3
1.2.3特异性检验3
1.2.4重复性检验3
1.2.4.1批内重复检验3
1.2.4.1批间重复检验3
2结果3
2.1NSs蛋白的SDSPAGE鉴定...............3
2.2 RVFV NSs蛋白阻断ELISA抗体检测方法的建立和反应条件优化4
2.2.1抗原包被和酶标抗体最佳稀释度的确定4
2.2.2待检血请最佳稀释 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
度的筛选4
2.2.3血清最佳孵育时间的筛选4
2.2.4酶标单抗的最佳作用时间的筛选4 2.2.5最佳显色时间的筛选5
2.2.6Outoff确定5
2.3特异性检验5 2.4重复性检验5 2.4.1批内重复检验6
2.4.2批间重复检验6
3讨论6 致谢6
参考文献7裂谷热病毒NSs蛋白阻断ELISA抗体检测方法的建立
引言
裂谷热(Rift Valley fever , RVF) 是因为裂谷热病毒 (Rift Valley fever virus ,RVFV) 所导致的一种传染性特别强的疾病，可导致反刍动物较大面积死亡以及人类出血热[1][2]。此病特别是在牛羊等反刍动物间流行甚广，孕畜感染该病可引起流产[3]，机体能够经过蚊虫叮咬进行传播或直接触碰动物血液而出现感染的情况。该种疾病第一次发现在肯尼亚，当地政府对该疾病进行报道，1931年这一国家的亚里夫特山谷中出现了大面积羊群的死亡的情况，所以发现了这一病毒。我国于2016年7月24日出现了第一例输入性该疾病的相关病例[4]。到现在来看，已经有30多个国家曾经表达，出现该疾病疫情[5]，该疾病已经被世界动物卫生组织列入必须通报的传染病。
产生该疾病的这一病毒的诊断手段包含有病原学测定，如RTPCR、Realtime PCR等，这上述手段有着操作简单、快速以及敏感特征较强等特点[2]；还有血清学测定技术，如酶联免疫吸附试验（ELISA）等，在这里ELISA检测速度快、并且方法十分的方面，能够在疫情的监测以及流行病学调查过程中很好的使用[6]。
RVFV核酸位于病毒的核衣壳内，为单股负链RNA，分S、M和L三个编码区，L区编码RNA依赖的RNA多聚酶；M区编码包膜糖蛋白G1和G2，裂解后分别产生2个大小为78 kD和14 kD附加的非结构蛋白；S区编码核壳蛋白N和非结构蛋白NSs，NSs蛋白在控制病毒毒力及感染宿主中发挥着重要作用[7]。本次实验确立了该种类型病毒NSs蛋白阻断ELISA抗体测定手段，经过对反应环境更好的优化，为这一传染病的有效测定以及流行病学的给予一个行之有效的检测方案，并且确立的手段能够当作野毒感染和灭活疫苗免疫抗体两者之间的鉴别提供相应的方案。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1主要试剂
RVFV NSs 蛋白及N蛋白阴阳性山羊血清、HRP标记的NSs蛋白单克隆抗体由实习所在单位实验室制备保存；IPTG、蛋白 Maker 购于北京全式金生物科技有限公司；GE公司亲和纯化柱；酶标单抗由本单位保存；其他试剂为国产分析纯级产品。
1.1.2主要仪器
蛋白电泳仪、电泳槽；酶标仪；37℃恒温培养箱；4℃冰箱；70℃冰箱；离心机。
1.2方法
1.2.1 NSs蛋白的纯化和蛋白浓度的检测
把体积为2mL的菌液放在LB（其中包含浓度为50µg/mL卡那霉素）液体培养基中对其进行培养，菌液放置在温度为37℃环境中进行培养，达到OD600为0.6时，用体积为0.5mL IPTG(浓度为200m/M)对其进行诱导，时间为5h后，收取样品进行相应的SDSPAGE电泳分析测定。运用超声振荡器将其细胞打碎，之后使用相应的缓冲液溶剂将破碎细胞留出来的蛋白取出，对其进行收集，对其进行相应的电泳分析检测，使用亲和层析手段纯化重组相应的蛋白，之后把纯化后的蛋白对其浓度进行相应的测定。相关方法如下所示：
将柱子上端黑色部位拧下换上红色部分，将下筏打开，用5体积蒸馏水淋洗柱体后按1mL/min推液。
用5倍柱体积Binding Buffer淋洗柱体。
用15倍柱体积Binding Buffer淋洗，分别用3个EP管收集前（第1次）、中（第5次）、后（第10次）的淋洗液的前1mL。
用5倍柱体积Elution Buffer洗脱，分别用5个EP管收集洗脱液，每管各1mL。
收取样品1mL作SDSPAGE电泳分析鉴定，8000r/min离心2min取上清到一个EP管，沉淀用50µL PBS洗3遍，分别取30µL加30µL Loding Buffer，煮沸10min，进行SDSPAGE分析。
1.2.2 RVFV NSs阻断ELISA抗体检测方法的建立和反应条件优化
1.2.2.1 抗原的包被浓度及酶标单抗最佳稀释度的确定
采用方阵滴定法，将RVFV NSs蛋白用抗原包被液稀释成0.5µg/mL、1µg/mL、2µg/mL、4µg/mL浓度，每孔分别加100µL, 4℃过夜；PBST洗涤3次；每孔需要加入体积为200µL包含浓度为0.5% BSA的PBST，温度为37℃环境下对其封闭，时间需要达到2h；PBST对其洗涤3次，每孔添加体积为100µL酶标单抗（其稀释比例为1:500、1:1000、1:1500、1:2000、1:2500、1:3000），温度为37℃环境下对其进行孵育，时间需达到1h；PBST对其进行洗涤，3次后每孔添加体积为50µL的显色液，显色需要避光进行，时间需长达10min。每孔添加体积为25µL的终止液，对其反应进行终止。读取相应的吸光度OD值。根据OD450值确定最佳抗原包被浓度和酶标单抗最佳稀释度。

原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/dwyx/562290.html