:绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, MO)可感染绵羊和山羊引起传染性胸膜肺炎，以纤维素渗出性肺炎为主要特征，该病呈全球性分布，很多国家地区都有该病发生。目前该病的最有效防控方法是研发有效的疫苗，目前国内的疫苗生产的研究进展比较缓慢，主要原因是支原体体外培养困难。因此，本研究对江苏省农科院提供的绵羊肺炎支原体进行了实验室传统的分离鉴定实验及分子生物学鉴定，并进行了DNA扩增，再此基础上进行了MO EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法，通过实验验证，该方法在特异性、敏感性和稳定性上优于普通PCR检测方法。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 4
1 动物支原体病的研究进展 4
2 绵羊支原体肺炎的研究进展 4
3 诊断 5
4 防治 6
5 本研究的目的及意义 6
1 材料与方法 6
1.1 标本来源及菌株 6
1.2 主要试剂 6
1.3 主要仪器 7
1.4 试验方法 7
2 结果与分析 9
2.1 标准质粒构建 9
2.2 两种标准质粒鉴定 9
2.3 两种羊支原体Evagreen荧光定量PCR扩增产物Tm值 9
2.4 两种羊支原体Evagreen实时荧光PCR特异性 10
2.5 两种羊支原体Evagreen实时荧光PCR灵敏度 11
3.讨论 12
4 总结 13
致谢 13
参考文献 13
绵羊肺炎支原体定量PCR方法的应用研究
引言
引言
1 动物支原体病的研究进展
早在200年前动物支原体对动物畜禽造成的危害就已经引起了人们的重视。支原体是一种以缺乏细胞壁合成物质为特点的一类无细胞壁、简单的最小的原核生物，首次发现是由名叫Nocard的科学家从牛胸膜肺炎的一例病例中分离得到，他当时给这种微生物命名为胸膜肺炎微生物（pl *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
eural pneumonia organism, PPO）。随后，随着科学知识的普及以及发展，人们陆续从其他途径比如人、猪、马、羊等动物或是土壤污水中分离得到了这种微生物。当时虽然发现了这种微生物，但未能将它与胸膜肺炎的致病原因联系起来，发现的这些微生物与Nocard发现的PPO形态极为相似，所以把它们称为类胸膜肺炎微生物(pleuropneumonia organism like organism, PPLO )。跟其他细菌微生物不同的是，支原体可以在无细胞的培养基上成长、但是要加入胆固醇来维持其需求，支原体自身缺乏细胞壁和合成细胞壁的物质，但是它自身能合成蛋白和酶，自己能形成自己的内环境，而且同时具有两种遗传物质、所以繁殖不需依赖宿主细胞的核酸，利用抗体或者抗生素能使该支原体生长受到抑制。常见的支原体种类比较多，本实验中主要研究对象为绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种（表1）。
表1 本次实验中涉及到的支原体种类及其致病特性
种名
模式株
寄生部位
致病性
绵羊肺炎支原体
Y98
绵羊、山羊呼吸道
非典型肺炎
丝状支原体山羊亚种
Pg3
山羊呼吸道
肺炎
2 绵羊支原体肺炎的研究进展
2.1 病原学
绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae，MO)主要感染绵羊，发病症状主要出现在肺脏，经常发生的是间质性非典型肺炎，该病原也能感染山羊，发生的病症类似，病变也主要出现在肺脏。MO早在20世纪就被人发现，并从发病绵羊的体内分离到，国内第一次分离到该病原则是在1982年，该病原有全球流行的趋势，并且传染迅速，这使得MO成为危害全世界养羊业的重要病原之一，它的存在严重影响了养羊业的发展。对比其他支原体属成员，Mo在实验室培养的难度很大。这直接导致人们对其致病机理、病原特性、免疫规律等方面的研究较其他落后。当今，实验室内培养MO所使用的培养基主要有几种，分别为改良型Hartleys、Hayflick培养基, KM2和FM4培养基。MO比起其他支原体的差别并不大，致病机理和病原性质等，但在菌落形态的表现上呈现特殊的“桑葚”样菌落。以此可以区别于其他支原体，这可能和其特殊的代谢途径有关，也可能和其基因结构有关，具体机理尚不清楚需要进一步研究证明。
2. 2流行病学
绵羊支原体肺炎为接触性传染。发病没有季节性，一年四季都可能感染该病，秋冬季发病最为显著，数量最多，饲养过程中不同阶段的羊只都能感染该病，羊羔因为免疫力还不完善，成为该病的易感对象，感染的羊只死亡率能达到30%以上。该病通常与其他病症混合感染出现，自然环境中存在的Mo在畜体感染其他疾病免疫力下降是，就会趁机侵染机体，同时Mo常常继发有其他病原菌的感染，和巴氏杆菌、化脓杆菌和肺炎链球菌等的混合感染较多。在Mo的致病性得到证实之后，人们对该病的了解逐渐深入，先后证明了绵羊支原体在全球分布，并且不受羊只种类影响，均能够感染该病。随着经济发展与科技进步，养羊业也在发展，羊群流通交易频繁，羊的养殖密度越来越大，为该病的传染流行奠定了基础，该病本身传染性强、发病率和死亡率高、根除困难，所以能对经济造成巨大损失。
2.3 临床症状与病理变化
感染绵羊主要的病症表现发生在呼吸系统，流鼻涕、咳嗽等症状，还会影响到羊的正常生长发育，使羊只出现渐进性消瘦和增生性间质性肺炎。该病分急性与慢性，急性者数日内就会死亡，病变主要在肺部，并且病症的表现能一眼认出；慢性者潜伏期长，也主要使肺部功能受到影响。示病性典型病变存在与肺脏中。有可能发生纤维素性肺炎，在肺脏表面附着有纤维素，严重时会与胸腔粘连，渗出纤维素性的胸腔积液样似稻草。区别于其他肺部感染，该病感染过程还会出现肺脏心叶充血。该病对其他的器官影响不大，没有明显的病变。
3 诊断
3.1 临床诊断与病理学诊断

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