目的 本试验旨在先将环磷酰胺腹腔注射造炎症动物模型，较长时间后，观察小鼠睾丸结构变化，精子凋亡状态、组织形态学和免疫组化等方法检测，最终观察小鼠的临床表现、生长的影响，深入理解环磷酰胺对男性生殖能力损伤机理。方法 20只雄性小鼠;随机分为2组，依次为空白对照组、模型组。除空白对照组外，其余小鼠腹腔注射环磷酰胺50mg /kg,连续注射7d,空白对照组腹腔注射等量生理盐水。后解剖并观察记录；再35d后取双侧睾丸，应用 HE 和TUNEL染色、精子涂片、免疫组织化学技术观察睾丸组织学变化、c⁃kit、connexin 43、N-cadherin、LGR5、AR及claudin在睾丸中的分布情况及表达变化。结果 环磷酰胺模型小鼠体重明显下降，且生命活动受到影响，精神萎靡，精曲小管萎缩，生精细胞及精子显著减少，未成熟精子数增多，c-kit与connexin43、N-cadherin、AR、claudin表达显著下调，而LGR5上调。 结论 本实验验证了环磷酰胺通过改变了精母细胞等生殖细胞的蛋白表达，致使睾丸生精细胞组织受损，从而引起生精障碍。
目录
环磷酰胺对小鼠睾丸结构与功能的影响 1
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1．1 试验材料 2
1．1．1 试验药物。 2
1．1．2 试验动物 2
1．1．3 试验材料 2
1．2 试验方法 3
1．2．1造模方法 3
1．2．2测定指标及方法 3
1．2．3 统计方法 4
2 结果与分析 4
2．1 临床表现 4
2．2 体重的影响 4
2．3 对器官指数的影响 5
2．4 对小鼠睾丸组织形态学的影响 6
2．5 TUNEL凋亡染色和精子涂片检测环磷酰胺对精子凋亡与形态的影响 6
2．6 免疫组化检测ckit、connexin 43、Ncadherien、LGR5、AR及claudin表达的变化 7
2．6．1免疫组化检测ckit的表达变化 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
7
2．6．2免疫组化检测connexin43的表达变化 8
2．6．3免疫组化检测Ncadherin的表达变化 8
2．6．4免疫组化检测LGR5的表达变化 8
2．6．5免疫组化检测AR的表达变化 9
2．6．6免疫组化检测Claudin的表达变化 9
3 讨论 10
3．1 环磷酰胺与雄性生殖系统 10
3．2 环磷酰胺对雄性小鼠生命活动和生殖器官的影响 10
3．3 环磷酰胺对精子凋亡和生精功能的影响 11
4 展望 12
致谢 12
参考文献： 13
环磷酰胺对小鼠睾丸结构与功能的影响
引言
随着现代医疗技术的发展，肿瘤作为早前让人束手无策的疾病到现代已有许多治疗的方法，肿瘤诊疗医治技术越来越先进，从之前的闻癌色变到现在恶性肿瘤患者的生存率也越来越高，目前，人类恶性肿瘤治疗后的生存者数量大大提高。而在当下的肿瘤类疾病医疗中，化学药物诊治是恶性肿瘤治疗的最基本方法，从当下来看，在这些化学药物中，环磷酰胺是临床肿瘤药物治疗中上最为常用的化学剂，其对身体的损伤已引起人们的重视。据报道，环磷酰胺对生殖系统的损伤在副作用损伤病例中最为常见，在诸多的病例中，尤其对于男性生育能力的损伤疾病报道最多。环磷酰胺（CP）是一种属于氮芥类的环磷酰胺酯类化合物在临床上多制作为口服活性烷基化剂，它将烷基引入细胞DNA链并阻止癌细胞生长，因此，它已被列为最主要的抗癌药物之一。另外有研究显示它的副作用中包括引起免疫抑制，因为有报道研究环磷酰胺会抑制机体的天然免疫反应。在临床研究中，男性患者中有大量报道了CP会导致部分抗癌治疗患者无法正常生育或有其它生育能力障碍，所以目前研究环磷酰胺对男性生殖损伤的机制能有效地保护男性生殖系统免受严重损伤。据文献报道，给予大鼠一次性腹腔注射环磷酰胺，剂量在75mg/kg以上可造成小鼠明显的生育力损害[1]，并且在损伤男性生殖系统的同时，还会对后代造成隐性的畸形疾病等问题，所以对生殖和后代的双重损伤使其成为当下的热门话题，也是肿瘤医学上研究的热点之一。当前医学研究上对环磷酰胺导致生殖系统损伤的研究主要包括环磷酰胺对生殖系统中睾丸、精原细胞、支持细胞和精子的影响。在生殖系统中存在很多重要的蛋白质，而本实验将对六种蛋白进行深入研究。Ckit是由975个氨基酸构成的在细胞膜上具有酪氨酸激酶活性的受体，精子发生是增殖和分化生殖细胞的过程，需要高度协调的细胞相互作用，因此ckit受体是睾丸精子发生过程中的关键分子。细胞间连接对维持睾丸细胞之间的通讯很重要 [2] ,间隙连接蛋白的作用十分关键，而连接蛋白43（connexin43）和钙黏蛋白N(Ncadherin)是在脊椎动物睾丸中形成间隙连接的最丰富的蛋白质[3]。所以二者对于雄性的性器官与腺体的发育、精子正常发生十分关键，可以说没有connexin43连接蛋白，雄性性器官、腺体与精子就不能正常发育发生。、LGR5是干细胞的标志物，其往往标志着机体器官的某些变化。AR（雄激素）是具有多种生物活性的物质，其在雄性生殖系统中的具有生精、调节产生性激素等作用，AR同时调控小鼠claudin的表达，所以本实验也将对claudin的表达情况进行测定。
1 材料与方法
1．1 试验材料
1．1．1 试验药物。
腹腔注射造模的药物环磷酰胺：其药物规格为0.2g,批号HA3001728，生产于江苏恒瑞医药股份有限公司；功能:导致雄性机体性器官及性腺体萎缩，睾丸尤其明显，精子发育停滞，成熟精子减少或无；用法与用量：试验用环磷酰胺规格200mg/瓶，对其进行稀释配制，用注射用针头吸取10ml的生理盐水并加入瓶内稀释摇匀配制成注射液。模型组小鼠腹腔注射环磷酰胺，剂量为50mg/kg, 7d连续注射，空白对照组用等量生理盐水腹腔注射，连续7d。
1．1．2 试验动物
试验动物: ICR小鼠，SPF级，雄性，8~9周龄；动物来源:南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，合格证SCXK (苏)20170001；饲养管理:饲养于大学逸夫楼六楼同位素放射性实验室动物房。试验动物需对环境温度有一定要求限定。应饲养于无噪音、清新干净无污染、无暴晒也不阴冷潮湿的自然光照下，温度控制在室温20℃左右，并且较少其它动物和昆虫等影响因素的环境，鼠粮饲料为全价颗粒饲料，不干扰其饮水和摄食行为。试验前先进行适应性饲养35天并经常记录观察，选择精神状态无异常且摄食饮水正常的小鼠进行实验。

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