猪支原体肺炎（mycoplasmal pneumonia of swine,MPS）是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引起猪的一种慢性呼吸道传染病。病猪生长缓慢,饲料利用率低，严重危害养猪业的健康发展。由nox基因编码的NADH氧化酶（NADH Oxidase，NOX）是一种氧化还原酶，参与生物体的氧化还原反应，对细菌的毒力调控和代谢产物均有影响。有研究证明，支原体的nox蛋白可同时作为活性NADH氧化酶和黏附素，是一种潜在的毒力因子。本研究是将猪肺炎支原体NADH氧化酶重组表达质粒nox-32a转化至BL21（DE3）感受态大肠杆菌，在此原核表达系统中以IPTG为诱导剂进行大量表达，将重组蛋白纯化并制备抗原后免疫新西兰大白兔，制备多抗高免血清。本研究诱导表达的NADH氧化酶经SDS-PAGE鉴定，证明该蛋白正确表达且抗原性较好；成功纯化出纯度在85%以上，浓度为2mg/mL的NADH氧化酶用以制备抗原；兔抗猪肺炎支原体NADH氧化酶高免血清经Western blot鉴定，证明该蛋白特异性良好；ELISA法检测血清效价结果为1:204800。本研究制备的多抗为进一步探索NADH氧化酶的功能提供材料。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1 引言1
1.1 病原学1
1.2 流行病学2
1.3 致病机制与临床症状2
1.4 NADH氧化酶概述2
1.5 目的与意义3
2 材料与方法3
2.1 材料3
2.2 重组蛋白的表达、鉴定及纯化4
2.2.1 重组蛋白的表达4
2.2.2 蛋白的大量表达4
2.2.3 超声4
2.2.4 包涵体表达的蛋白纯化4
2.2.5 透析法对纯化的蛋白进行复性4
2.2.6 超滤浓缩换液5
2.3 兔抗猪肺炎支原体NADH氧化酶高免血清的制备5
2.3.1 免疫抗原制备5
2.3.2 免疫与观察5
2.3. *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
3 采血5
2.3.4 抗体检测5
3 结果与分析6
3.1 鉴定NADH氧化酶表达的类型6
3.2 NADH氧化酶纯化及复性结果分析6
3.3 IHA抗体检测7
3.4 纯化蛋白Western blot结果分析7
3.5 高免血清Western blot结果分析7
3.6 ELISA检测结果8
4 讨论8
致谢9
参考文献9
图1 蛋白表达鉴定SDSPAGE分析6
图2 蛋白纯化SDSPAGE分析7
图3 纯化蛋白Western Blot鉴定7
图4 高免血清Western Blot鉴定8
表1 高免血清ELISA检测结果8猪肺炎支原体NADH氧化酶的原核表达及多抗制备
引言
1 引言
1．1 病原学
猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS）又称为猪地方流行性肺炎（Swine enzootic pneumonia），俗称猪喘气病或气喘病，其病原体为猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）。Mhp是一种柔膜细菌[1]，无细胞壁，因此其形态呈明显多样性，如环形、球形、杆形等[2]。菌体体积微小，处于细菌与病毒之间，革兰染色结果呈阴性，但着色效果差，吉姆萨或瑞氏染色效果较好。Mhp具有无细胞壁的结构特点，所以在外部施加压力的作用下，菌体可通过产生形变而穿过0.22μm的滤膜[3]，因此可用过滤法来提纯其他细菌造成的污染。对Mhp分离培养时需严格要求培养基的营养构成，在一般的培养基中很难生长，因此，体外培养是研究Mhp的重大难题[4]。Mhp对自然环境抵抗力不强，常用的化学消毒剂即可达到消毒目的，常用的抗生素类药物如：泰乐菌素、土霉素、四环素等对Mhp均有良好的治疗效果[5]。从长远的角度看，在运用抗生素进行有效治疗的同时要防止药物的滥用，防止细菌耐药性的产生具有重大意义。
1．2 流行病学
MPS是世界范围内重要的猪传染病，据统计，仅有10％～30％的猪群未感染，发病率超过40％[6]。在我国，猪群每年因感染Mhp导致死亡或发育不良而造成的经济损失在40亿元以上[7]。MPS的自然病例仅见于猪，虽然不同年龄、性别和品种的猪均可感染，但是乳猪和断乳仔猪最易感且发病率、死亡率均较高。病猪和带菌猪是主要传染源。病猪与健康猪的直接接触、带有细菌的飞沫进入空气以及母猪对于仔猪的垂直传播均是本病的传播途径[8]。本病传播距离较广，可达150m以上，甚至达3000m左右[9]。
在新发病地区往往是因为引种时检疫不彻底，导致引进受感染的猪，使健康猪群感染发病。而在老疫区，主要的传染源是患病母猪，仔猪易受到患病母猪的传染导致新生仔猪易患病。未彻底痊愈、仍存在隐性感染的猪，症状虽然有所缓解甚至消失，但还有传播本病的能力。因此，本病一旦侵袭猪场，很难进行彻底净化。本病虽然无明显季节性，但气温骤变和气候恶劣时发病情况明显上升，如：雨水增多、天气寒冷等[10]。此外，饲养管理水平和畜舍卫生条件也是影响本病发病率和死亡率的重要因素，如：饲料营养成分低、猪舍空气流通较差及猪群密集等。
1．3 致病机制和临床症状
Mhp是一种黏膜病原体，黏附在猪气管、支气管和气管上皮细胞上。在感染时，Mhp首先附着于纤毛上皮细胞表面，随后感染的细胞萎缩、死亡，纤毛大面积脱落，失去清除体外异物的功能。纤毛脱落后，进入呼吸道的异物、病原微生物以及呼吸道的分泌物等无法正常排出。这不仅可造成其他病原微生物继发感染，而且长期聚集在支气管和肺部的异物、病原微生物以及分泌物可导致肺部实变，严重影响猪呼吸系统的功能[11]。Mhp可导致免疫抑制，TS细胞活性增强，肺泡巨噬细胞活性下降，长时间患病可使机体免疫力显著下降，使其他病原体更容易感染动物，出现多症状混合感染或继发感染的情况[9]，比如受猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）的继发感染，死亡率会进一步上升[12]。

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