为猪瘟（classical swine fever ,CSF）是高致死性、烈性传染病，属于中国动物疫病防控工作中的一类动物疫病，一直以来影响着我国养猪业的发展。为了建立一种快速、敏感、特异的猪瘟病毒（Classical swine fever virus ,CSFV）实时荧光定量检测方法，本研究根据Ct值与模板浓度的关系建立了标准曲线。通过实验表明，该方法的溶解曲线有单一特异峰，具有良好的特异性；至少能检出猪瘟病毒的核酸浓度为100（copies/μL），敏感性较好；重复性试验变异系数均低于4%，重复性较强。本研究根据Genbank的猪瘟病毒的NS5B基因的特异性核酸序列设计引物，PCR反应后得到160bp的片段，将扩增产物与pMD19-T载体连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑选阳性单克隆子，提取重组质粒，测序鉴定后测其浓度，作为标准模板，得到R2=0.9928的标准曲线。扩增产物的溶解曲线中只有一个特异峰，说明没有引物二聚体，特异性好。病毒的最低检出量为100（copies/μL）。批内实验和批间实验的变异率均低于4%，表明该方法具有较好的稳定性和重复性。对20份疑似猪瘟样本进行检测后，与常规PCR结果进行比较分析，结果表明该方法具有较强的灵敏性和准确率。本次试验成功建立了适应于猪瘟NS5B蛋白的猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法，为快速检测提供了一种特异、灵敏的可参考方法，为CSFV的流行病学监测和管理提供了便利。本实验为疑似病例的快速诊断及病毒的定量分析提供了简便有效的方法，为CSFV的流行病学监测和管理提供了便利。
目录
摘要 4
关键词 4
Abstract 4
Key words 4
1 材料与方法 5
1.1 主要材料 5
1.1.1 毒株 5
1.1.2 试剂 5
1.1.3 仪器 6
1.2 重组质粒制备方法 6
1.2.1 引物设计与合成 6
1.2.2 病毒核酸抽提 6
1.2.3 反转录 6
1.2.4 CSFV NS5B目的基因片段扩增 6
1.2.5 回收产物与载体连接 8
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6 连接产物的转化 8
1.3 研究方法 9
1.3.1 制作pMD19TCSFV NS5B 标准品和标准曲线 9
1.3.2 pMD19TCSFV NS5B 特异性检验 10
1.3.3 pMD19TCSFV NS5B 敏感性的检验 10
1.3.4 pMD19TCSFV NS5B重复性检验 10
1.3.5 临床样品检测 10
2 结果及分析 10
2.1 CSFV NS5B特异性引物的扩增 10
2.2 CSFV NS5B重组质粒的测序 11
2.3 CSFV NS5B荧光定量PCR标准曲线绘制 11
2.4 CSFV NS5B特异性试验 11
2.5 CSFV NS5B敏感性试验 12
2.6 CSFV NS5B重复性试验 12
2.7 临床样品的检测 13
3 讨论 14
致谢 14
参考文献 14
猪瘟病毒NS5B蛋白实时荧光定量PCR方法的建立及应用

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