猪流行性腹泻病毒（PEDV）是冠状病毒科α-冠状病毒属的一员，近年对我国养猪业带来了巨大的经济损失，因此研究其复制机制对防控此病有重大意义。为了筛选对PEDV复制有影响的宿主蛋白，本实验利用RNA干扰技术，针对7个基因，FILIP1L，EPB41L3，SAMD02，WDFY4，K1F26B，AP0A1，CWC25设计了特异性的siRNA，将siRNA转染到哺乳动物细胞中进行基因干扰，抑制蛋白表达，再感染PEDV，运用荧光定量技术测病毒的拷贝数的变化，筛选对PEDV复制有影响的宿主蛋白。结果显示siFILIP1L，siEPB41L3对病毒复制有显著影响，并用Western-blot验证对应蛋白内源性表达降低，再对两种siRNA对PEDV复制周期造成的影响进行了初步摸索，明确了宿主蛋白影响病毒复制的环节，为研究该蛋白在PEDV复制中的分子机制奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1绪论1
1.1 PEDV流行特点1
1.2 PEDV生物学特点 2
1.2.1 PEDV的结构2
1.2.2 PEDV的特点2
1.3 RNA干扰技术3
1.4研究目的与意义3
2材料和方法3
2.1细胞与病毒3
2.2主要仪器与设备3
2.3主要试剂溶液4
2.4细胞培养4
2.5siRNA筛选与验证4
2.5.1转染4
2.5.2接种病毒4
2.5.3样品收集5
2.5.3.1 病毒收集5
2.5.3.2 RNA的提取5
2.5.3.3 Westernblot条件设置5
2.6数据统计分析5
3.结果与分析6
3.1干扰相关基因表达对PEDV复制的影响6
3.2 siFILIP1L、siEPB41L3的干扰效果验证6
3.3 FILIP1L和EPB41L3对PEDV复制的影响7
3.4 FILIP1L和EPB41L3在不同感染阶段对PEDV *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
复制的影响8
4.讨论9
致谢9
参考文献9
影响PEDV复制的宿主蛋白筛选
引言
绪论
1.1 PEDV流行特点
猪流行性腹泻病毒（PEDV），属于冠状病毒科α冠状病毒属，其感染通常引起新生儿仔猪出现呕吐、腹泻、脱水甚至死亡等临床症状，严重危害养猪业的健康发展。近三十年来，PEDV感染在欧洲、亚洲等全球范围内广泛流行。2013年5月，美国突然暴发PED，仅 1 年的流行期就造成了大规模新生仔猪死亡[1]。 地方性的PEDV变异也是是一个重要的问题，多个PEDV变异体的出现（或潜在的进口）使病情变得恶化和复杂。
1.2 PEDV的生物学特点
1.2.1 PEDV的结构
PEDV为单链正链、不分节段的RNA病毒，基因组全长约为28 kb，主编码四种结构蛋白，即纤突蛋白（E）、膜蛋白（M）、纤突糖蛋白（S）、核衣壳（N）蛋白，除此之外，猪流行性腹泻病毒内部的基因组 5′端还具有 1a 和 1b 两大开放框架（ORFs），分别编码 pp1a 和 pp1b 这 2 种非结构性蛋白，而 3′端则是非翻译区，末端链接 Poly（A）序列[15]。
S蛋白与体外生长适应和体内PEDV毒力的减弱有关，且强毒株与弱毒株的主要差异主要集中在编码S蛋白的基因上。编码核衣壳蛋白的N基因具有高度的保守性，因此可以作为与其他腹泻病毒鉴别诊断的标识。膜蛋白是病毒蛋白中占比最大的成分，在病毒的装配中起着重要作用[13]。N蛋白的主要作用是与RNA结合，将病毒基因组RNA装配在核衣壳中，促进病毒的复制[14]。四种蛋白参与 PEDV 与宿主细胞的融合、病毒复制以及机体的免疫应答，决定病毒性状。


图1 PEDV的病毒粒子模型
1.2.2 PEDV的特点
研究表明， PEDV易被乙醚或氯仿等有机溶剂灭活，在pH 38的细胞培养基中培养6 h，PEDV仍然能表现出低到中等的活性，而pH <4的酸性消毒液或pH >9的碱性有机溶液可以使病毒完全失活。有研究表明，如果PEDV对温度的抵抗力较强，在较高的温度（>37 °C）下放置3 h仍然能保持感染性[16]。
1.3 RNA干扰技术
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（doublestranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象[17]。当外源性基因随机整合到宿主细胞基因组中，利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的21～23 bp小片段RNA，即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNAinduced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的特异性结合，利用其核酸酶活性在结合部位切割mRNA，被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应[18]。基于此，siRNA可以作为抑制特定基因表达的有效手段之一，被广泛用于各种生物学研究。
1.4 研究目的与意义
PEDV在宿主细胞内的复制是其形成感染的首要条件之一，其复制过程需要宿主中多种蛋白参与，因此通过筛选与PEDV复制有关的宿主蛋白可能成为有效防控其感染的突破口。为此，本试验在实验室前期研究基础上，筛选可能与PEDV复制有关的宿主蛋白，对其在PEDV复制中的作用进行验证，以期为PEDV的有效防控提供参考。
材料与方法
2.1 细胞与病毒
PEDVAH2012/12毒株和非洲绿猴肾细胞（Vero81）细胞均由江苏省农业科学院兽医研究所人兽共患防控研究室保存。
2.2 主要仪器与设备
名 称
型 号
生产商
PCR 仪
Nexus X2
Eppendof

原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/dwyx/562242.html