确定壳聚糖（CS）作为材料基础，分别采用β-甘油磷酸钠（β-GP）、羟丙基甲基纤维素（HPMC）和甘油作为添加剂制备不同体系的温敏水凝胶，比较后选出最优体系为CS含量为1%（W/V），HPMC黏度为6mPa·s，HPMC含量为6%（W/V）,甘油含量为29%（W/V），得到的溶液通针性良好，可以在37℃下于10min内凝胶化。通过细胞毒性（DTT）试验表明该体系无毒副作用。在小鼠皮下注射试验中能带来有效免疫效力。研究结果表明该体系是一种生物相容性良好的可注射温敏水凝胶。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1 水凝胶的制备4
1.1.1 主要试剂4
1.1.2 主要仪器设备4
1.1.3 CS/βGP凝胶的制4
1.1.4 CS/HPMC凝胶的制备4
1.2 最低临界溶解温度的测定4
1.3 凝胶时间的测定4
1.4 溶液内物质比例的影响和筛选4
1.5 温敏凝胶溶液佐剂疫苗的制备4
1.5.1 CS/βGP体系的混合方法5
1.5.2 CS/HPMC体系的混合方法5
1.6 细胞增殖毒性检测5
1.6.1 细胞培养5
1.6.2 细胞毒性试验5
1.7 动物实验5
2 结果与分析5
2.1 CS/βGP凝胶体系的筛选5
2.1.1 CS含量对溶液制备的影响5
2.1.2 βGP含量对LCST的影响6
2.1.3 CS脱乙酰度对成胶的影响6
2.1.4 因素组合实验6
2.2 CS/HPMC凝胶体系的筛选6
2.2.1 CS含量对LCST的影响7
2.2.2 HPMC含量对LCST的影响7
2.2.3 甘油含量对LCST的影响7
2.2.4 因素组合实验7
2.3 最优配比筛选7
2.4 细胞毒性试 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
验8
2.5 动物免疫实验8
3 讨论 8
3.1 温敏凝胶溶液的制备与筛选8
3.2 生物相容性和免疫作用讨论9
3.3 结论9
致谢10
参考文献10
图1 CS/βGP混合溶液37℃下凝胶形态6
图2 存放3天后出现的絮状析出6
图3 95脱乙酰度下出现的沉淀团块6
图4 CS/HPMC混合溶液的溶液状态7
图5 CS/HPMC混合溶液的凝胶态7
表1 CS/βGP混合溶液制备的体系筛选组合6
表2 CS/HPMC混合溶液制备的体系筛选组合7
表3 细胞毒性试验的最终结果8
表4 小鼠免疫后第四周血清OVA抗体ELISA检测结果8
壳聚糖温敏水凝胶体系的制备筛选及其免疫效果研究
引言
温敏原位凝胶（thermosensitive in situ gel），或称温敏水凝胶，是一类以溶液状态给药后，能在用药部位短时间内发生相转变，形成非化学交联的半固体凝胶制剂。物理交联是在外界环境刺激下的聚合物自身改变，在凝胶形成过程中不会产生物质的变化，不会释放能量，基本不发生体积改变。相比于化学交联，更容易适应生物体内复杂的内环境，对生物体也更友好。常见动物与人体的生理温度恒定且与外界存在明显差异，使得温度敏感型水凝胶能在外界以相对易保存，易注射的溶液形式存在，进入体内又发生凝胶化从而发挥作用，所以广泛实用于各类医学生物材料的制作，在人体内产生缓释，加强免疫，降低药物毒性等效果。
壳聚糖（chitosan，CS）[1]是甲壳素在高温条件下通过碱性处理脱乙酰化得到的产物，是一种自然界中存在的碱性多糖，可以溶于酸性溶液中。CS作为一种良好的天然大分子生物材料，已经被运用于多种医学产品中，具有抗氧化，抗菌抑制炎症，调节免疫和动物机体脂质代谢等生物学功能。
CS本身不具有温敏凝胶的特性，需要与可产生温敏特性的物质混合才能制成温敏水凝胶。研究最多的是甘油磷酸钠（GP）[2]，制备方法简便快速，但形成的凝胶结构疏松，强度较低。其中常用βGP的构型，但若是使用αβGP的构型[3]，空间位阻更小，凝胶速度更快。同时还有使用多糖衍生物的羟丙基甲基纤维素（HPMC），强度更高但直接温敏性能较差，需要其他添加剂进行调节。本文使用了两种制备方法，并对制备和其影响因素进行了分析，同时进行了筛选后的细胞实验和动物实验。
1 材料与方法
1．1 水凝胶的制备
1．1．1 主要试剂 壳聚糖（CS，脱乙酰度≥75%，脱乙酰度 75%~85%，Sigma，分析纯）、壳聚糖（CS，脱乙酰度≥85%，源叶生物，生物技术级）、壳聚糖（脱乙酰度≥90%，脱乙酰度≥95%，，上海麦克林科技生物有限公司，生物技术级），β甘油磷酸钠（βGP，Sigma，分析纯），醋酸（AC，西陇科学，分析纯）、实验室用去离子水（自制）、羟丙基甲基纤维素（HPMC，甲氧基含量28.0~30.0%，羟丙基7.0~12.0%，黏度值6mPas， Sigma，分析纯），甘油（翼飞雪生物科技，分析纯）。
1．1．2 主要仪器设备 电子天平（上海卓精电子科技有限公司），水浴锅（上海珂淮仪器有限公司），恒温磁力搅拌器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司），4℃冰箱（中国海尔集团）。
1．1．3 CS/βGP凝胶的制备 用量筒量取1.143mL冰醋酸移入200mL容量瓶，配成0.1mol/L的乙酸溶液。用电子天平称取一定量βGP溶于去离子水配成6%~10%（W/V）浓度的溶液，称取一定量的CS粉末，溶于配好的乙酸溶液，制成1%~2%（W/V）浓度的CS溶液。将两溶液放入冰箱中4℃恒温0.5h。用移液管移取CS溶液，在冰水浴和搅拌下，将βGP溶液缓慢滴加到CS溶液中，并在冰水浴条件下继续搅拌。制备后放置到4℃冰箱保存。
1．1．4 CS/HPMC凝胶的制备 用量筒量取1mL冰醋酸移入200mL容量瓶，配成0.5%的乙酸溶液。用电子天平称取一定量HPMC和CS粉末，使CS在终溶液中浓度为1%~2%，HPMC在终溶液中浓度为4%~8%。取一定量乙酸溶液，放于85℃的水浴锅中加热5min。将混合的粉末加入到热乙酸溶液中，放到恒温磁力搅拌器上搅拌溶解10min。等待溶液溶解均匀后，滴加适量甘油，使甘油在终溶液中的浓度为29%~31%。将溶液混合均匀，制备后放置到4℃冰箱保存。

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