乙型脑炎是一种由乙型脑炎病毒引起的人畜共患传染病，目前尚无治疗的特效性药物。前期研究发现整合素αvβ3在JEV感染细胞过程中发挥作用，但机制未明。本研究进一步探究整合素αvβ3在JEV感染细胞中的受体功能，利用 CRISPR/Cas9技术敲除293T细胞中的整合素αvβ3蛋白，构建细胞模型以探究整合素αvβ3蛋白缺失对细胞感染乙型脑炎病毒的影响。针对整合素αv蛋白基因的第4外显子设计2个sgRNA，构建重组表达载体pX458-αv-sgRNA。将重组质粒转染293T细胞，利用有限稀释法筛选并培养单克隆细胞。再利用蛋白免疫印迹实验，聚合酶链式反应，TA克隆测序检测是否成功敲除。最后，用JEV感染正常细胞和敲除细胞。收集细胞和上清样品，使用Western-blot，空斑试验，real time PCR实验，检测JEV的感染情况。结果表明，在敲除细胞株基因组中存在碱基缺失，证明可以利用CRISPR/Cas9技术敲除整合素αv基因，并构建了整合素αvβ3基因缺失的293T细胞系。JEV感染整合素αvβ3基因缺失的细胞后出现了感染效率低的现象，证明细胞整合素αvβ3基因的缺失降低了JEV 的感染。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1材料与试剂4
1.2．方法4
1.2.1构建敲除整合素的细胞体系4
1.2.1.1验证293T、A549细胞中整合素beta 3以及alpha 5 蛋白表达情况4
1.2.1.2 pX458αvsgRNA质粒构建4
1.2.1.3细胞转染4
1.2.1.4验证转染效率5
1.2.1.5亚克隆细胞5
1.2.2敲除整合素αvβ3基因的293T细胞株的筛选5
1.2.2.1免疫印迹筛选可能的阳性样本5
1.2.2.2 PCR产物纯化后测序5
1.2.2.3 PCR产物连接T载体测序5
1.2.3探究整合素缺失对细胞感染病毒的影响6
1.2.3.1细胞感染JEV病毒，Westernblot检测JEV蛋白表达水 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
平 6
1.2.3.2空斑实验测定上清液中病毒滴度6
1.2.3.3提核酸及real time PCR 6
2结果与分析7
2.1成功构建敲除整合素αvβ3的细胞体系7
2.1.1 293T细胞中整合素alpha 5有较高蛋白表达量7
2.1.2成功构建重组质粒pX458αvsgRNA 7
2.1.3重组质粒pX458αvsgRNA成功转染至293T细胞8
2.2敲除整合素αvβ3基因的293T细胞株的筛选结果 8
2.2.1蛋白免疫印迹试验检测H细胞中整合素αv有较低的蛋白表达量 9
2.2.2 H细胞的PCR产物纯化后的测序结果出现双峰 9
2.2.3 PCR产物连接T载体后的测序结果 9
2.3整合素缺失降低并延迟了了细胞对病毒的感染10
2.3.1 细胞感染JEV后，Westernblot检测到整合素敲除的293T细胞感染JEV的能力下降10
2.3.2 空斑实验检测上清液中病毒滴度的结果 11
2.3.3 整合素αv基因敲除细胞感染JEV的定量RTPCR检测结果 11
3 讨论 13
致谢 13
参考文献 14
利用CRISPRCas9技术探究整合素αvβ3缺失对JEV感染细胞的影响

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