为筛选合适粘度的白油作为鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的佐剂，本试验通过对HLB值和不同粘度白油佐剂的筛选并制备鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗，对7日龄商品肉鸡进行免疫，免疫后21日和28日分别采血，分离血清，采取血凝抑制试验检测免疫受试鸡的血清抗体水平以评价其免疫效果。结果表明，HLB值为7时所制备的二联疫苗较为稳定，粘度最低，粒径最小，分布较均匀，更利于疫苗注射和吸收；血清抗体效价结果表明，使用低粘度白油KF-40制备的疫苗免疫效果较好，较低粘度白油能在保证疫苗稳定性的同时使机体产生更多抗体，免疫效果也更好。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1 试验用试剂及实验动物2
1.1.2 仪器设备2
1.2 方法 3
1.2.1 病毒浓缩灭活3
1.2.2 按不同HLB值制备疫苗3
1.2.3疫苗物理性状测定3
1.2.4 用不同粘度白油制备疫苗3
1.2.5 动物实验3
1.2.6 血凝抑制试验（HI）检测抗体效价3
2 结果4
2.1 病毒原液浓缩灭活4
2.2 按不同HLB值制备的疫苗稳定性比较4
2.3 用不同粘度白油制备疫苗5
2.4 血清抗体效价比较6
3 讨论 8
致谢9
参考文献10
不同粘度白油佐剂鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗对肉鸡免疫效果的影响
引言
鸡新城疫是由鸡新城疫病毒引起的鸡和各种禽类的一种急性高度接触性传染病，患鸡的病死率高。其临床特征表现为患鸡出现呼吸困难、腹泻、神经紊乱、粘膜和浆膜出血等，是严重危害养禽业的重要疾病之一，可造成巨大的经济损失。[1]H9亚型禽流感是由H9亚型禽流感病毒引起的对肉鸡养殖业危害比较严重的动物疫病之一，[2]H9亚型禽流感病毒感染鸡群后会造成大面积呼吸系统疾病，同时严重影响生殖系统，导致产蛋鸡群的产蛋量大幅下降，从而导致严重经济损失。[3]随着我国养 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
禽业养殖水平以及疾病防控水平的逐渐提高，鸡新城疫和禽流感已通过疫苗免疫接种得到较好的控制。[4]而在鸡新城疫和禽流感疫苗防控中，油乳剂灭活疫苗由于具有免疫效果确实、安全性高、免疫持续时间长和生产成本低等优点得到最为广泛的应用。
目前我国用于鸡新城疫、禽流感等畜禽重要疫病免疫的油乳灭活苗佐剂主要辅料成分几乎都是白油，因而白油的品质对于保障疫苗生产的质量也显得至关重要。[5]白油佐剂可直接影响疫苗的稳定性及免疫效果，其中白油粘度是其重要参数之一，低粘度白油容易影响油乳剂的稳定性，但高粘度白油又不宜用于机体免疫。[6]因此，选择合适粘度的白油对于疫苗制备及其质量控制显得十分关键。选择合适粘度的白油不仅可以提高疫苗的稳定性，而且可以使机体产生高效价的抗体并维持更长的免疫持续期。依照中国兽药典相关要求，[7]鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗应为油包水剂型，而疫苗剂型主要由HLB值（表面活性剂分子中亲水基和亲油基之间的大小和力量平衡程度的量）决定，[8]按不同HLB值配制的油包水剂型疫苗的性状和稳定性会存在差异，因此筛选合适的HLB值对于制备出稳定的疫苗至关重要。
为筛选合适粘度的白油作为鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的佐剂，本研究通过筛选合适HLB值和使用不同粘度的白油佐剂制备鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗，对商品肉鸡进行免疫，比较免疫鸡群血清抗体水平以筛选出免疫效果好、安全性高的白油佐剂，为鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的实际生产提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验用试剂及实验动物 鸡新城疫病毒La Sota株及禽流感病毒（H9亚型Hp株）病毒原液、灭活检验用鸡胚、灭菌检验用TG及TSB培养基、1日龄实验用肉鸡均由天津瑞普生物技术股份有限公司提供；KF32、KF40、KF50、Marcol52及国产白油均由天津瑞普生物技术有限公司天津空港分公司提供；Span80和Tween80为进口乳化剂。
1.1.2 仪器设备 高速冷冻离心机（CR21GⅢ型）为日本HITACHI公司产品；台式冷冻离心机（3K15）为北京五洲有限公司产品；高速剪切分散乳化机为FLUKO公司产品；恒温培养振荡器为上海智城分析仪器制造有限公司产品；磁力搅拌器（781）为金坛杰瑞尔有限公司产品；旋转式粘度计（NDJ1）为上海精科天美科学仪器有限公司产品；激光粒度分布仪（BT9300H）为丹东市百特仪器有限公司产品；高压蒸汽灭菌锅（GI54DS）为北京德泉兴业商贸有限公司产品；无菌超净台（SCWCJ1B）为杭州汇尔仪器有限公司产品。
1.2 方法
1.2.1 病毒浓缩灭活 （1）将300kDa的超滤膜包安装好后，用0.5mol/L NaOH溶液除菌，循环约30min；（2）用经0.45μm滤膜过滤后的水冲洗膜包至出样口液体pH为7.0左右；（3）病毒原液浓缩前需离心过滤，4℃、6000rpm离心5min，取上清，双层纱布过滤，总体积大约1800mL；（4）排空膜包内液体，进行病毒液浓缩，浓缩至600mL左右后用生理盐水定容至600mL；（5）浓缩好的病毒原液进行无菌检验，即于超净台内接种TG小管2支，每支0.2mL，1支置于35℃~37℃培养，1支置23℃~25℃培养，另取0.2mL，接种1支TSB小管，置23℃~25℃培养，均培养7日，应无菌生长；（6）检验合格的病毒液用0.1%甲醛进行灭活，于37℃、120rpm摇床上摇晃18h；（7）灭活好的毒液接种鸡胚尿囊腔，进行灭活效果检验。接种24~68h内鸡胚非特异性死亡不超过20%，死亡鸡胚尿囊液对鸡红细胞凝集试验为阴性，120h收集活胚尿囊液混合，鸡红细胞凝集试验为阴性者为灭活成功，确认灭活成功的两种毒液混合后于4℃保存备用。

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