本研究基于链霉亲和素偶联修饰的磁珠（SDB）分离系统和纳米金（AuNPs）信号放大系统，构建了一种适用于多种抗生素同时检测的比色适体生物传感器。实验选用卡那霉素（KAN）及土霉素（OTC）作为测定抗生素，制备了抗生素核酸适配体（APT）与含部分互补序列的生物素标记探针（CP）杂交双链修饰的SDB以及生物素标记的信号探针（SP）与含CP部分互补序列的帮助探针（HP）修饰的AuNPs。当溶液中存在待测抗生素时，由于APT与带测抗生素之间的特异性识别形成APT-抗生素复合物，使得APT从SDB表面释放，紧接着单链CP可与修饰了辣根过氧化物酶（HRP）的纳米金颗粒结合，进而催化3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB）和邻苯二胺（OPD）底物显色，利用TMB和OPD在370 nm或450 nm处紫外特征峰值的变化进行抗生素含量的灵敏检测。实验结果表明，该生物比色适体传感器具有良好的灵敏性和特异性，可实现10-6至105 pg·mL-1范围内OTC及KAN的线性检测，检测限低至1 ag·mL-1。牛奶样品检测结果证实，该比色适体生物传感器可用于实际食品监测和临床诊断。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 2
1 引言 3
1.1 抗生素检测意义及传统检测手段 3
1.2 比色法与核酸适配体的应用 3
1.3 纳米磁珠及金纳米颗粒的应用 3
2 材料与方法 4
2.1 材料 4
2.1.1 实验药品 4
2.1.2 缓冲溶液 4
2.1.3 实验仪器 5
2.2 方法 5
2.2.1 SDB上CP/APT的修饰 5
2.2.2 AuNPs的制备 5
2.2.3 AuNPs上SP/HP的修饰 5
2.2.4 抗生素与适体结合 5
2.2.5 纳米金信号放大 5
2.2.6 比色定量检测 5
3 结果 6
3.1 该传感器可行性的验证 6
3.2 该传感器信号放大性能的验证 7
3.3 该传感器检测性能的优化 7 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 

3.3.1 CP孵育浓度及SDBOTC/KNA浓度的优化 7
3.3.2 SP/HP修饰比例及HRP结合时间的优化 8
3.3.3 底物催化时间的优化 8
3.4 该传感器特异性验证 9
3.5 OTC和KAN线性检测范围的确定 10
3.6 该传感器在实际牛奶样品中的应用 11
4 讨论 11
致谢 12
参考文献 12
一种基于磁珠和纳米金信号放大的多种抗生素同时检测的比色适体生物传感器
引言
1 引言
抗生素应用于畜牧业以来，在动物疾病防治、提高饲料利用率、促进畜禽生长等方面发挥了重要作用[1]。但伴随着集约化养殖的发展，人们为了追求更高的经济效益不按规定大量使用抗生素，使动物源性食品中残留抗生素的可能性大大提高。因此，该类食品中抗生素残留问题也愈发被重视。而传统抗生素检测方法因其操作复杂、灵敏度低、价格昂贵等缺陷愈发不能满足实际检测要求，目前迫切需要一系列高灵敏度、高效快捷、价格低廉的抗生素检测方法以应用于食品安全检测和临床诊断。
1.1 抗生素检测意义及传统检测手段
抗生素是一类天然的、人工合成或半合成的生物活性次级代谢产物，因可改善禽畜肉蛋品质及治疗细菌性疾病[2]，被广泛应用于实际生产生活。然而它的不合理及过度使用会导致其在食品和环境中的残留[3]。残留抗生素可通过食物链在人体内积聚，造成过敏、变态反应以及“三致”作用，严重影响人类身体健康。同时低浓度抗生素长期接触病原菌可使细菌产生耐药性，增加人畜疾病的治疗难度[4]。残留于环境中的抗生素则会破坏土壤水源中原有微生物系统，通过食物链进而影响整个生态系统平衡。此外在牛奶中残留的抗生素还会抑制微生物发酵，导致奶酪或酸奶等乳发酵制品质量下降，对乳制品行业造成巨大经济损失[5]。
传统的抗生素分析方法包括ELISA、滴定法、高效液相色谱法、质谱法、免疫荧光技术、毛细管电泳、表面等离子体共振和电化学生物传感器等[611]。然而，这些方法往往存在前处理繁琐、仪器昂贵、洗涤孵育等待时间长、检测范围狭窄、易检出假阳性等缺点。对此，目前应该尝试设计更优秀的检测手段以满足实际食品安全检测抗生素快速、灵敏、便捷的需求。
1.2 比色法与核酸适配体的应用
比色法是一种通过肉眼观察或者光电比色计测量溶液颜色，利用颜色深度与物质浓度的线性关系以确定溶液中组分含量的检测手段[12]。根据分子的相互作用类型进行分类，可分为化学传感器和生物传感器。比色法因可视性、无需复杂设备且易于实现即时检测等优点，并且可通过结合一系列生物传感器以提升其检测灵敏度和检测范围，在病原体、抗生素、水体污染物等微量物质检测中具有非常重要的实际应用价值。
核酸适配体是一种通过SELEX技术筛选得到的具有特定空间结构的单链DNA或RNA序列，因对不同的靶标分子都具有高特异性和亲和性，其作为一种新的生物识别元件而受到广泛关注[13]。与传统蛋白质类抗体相比，核酸适配体具有以下独特的技术优势[14]：（1）相对分子量较小且易于化学修饰；（2）靶识别范围广，能够得到针对不同靶标的适配体序列；（3）获得方式容易，通过SELEX技术筛选得到的适配体序列可通过PCR技术进行规模化制备；（4）特异性好亲和力高，可识别抗体无法结合的小分子和离子。基于以上优点，核酸适配体的生物传感器常作为抗体的有效替代运用于各类检测体系[15]。
1.3 纳米磁珠及金纳米颗粒的应用
纳米技术在当前传感器技术中发挥着重要作用。纳米磁珠是一类纳米尺度范围的磁性颗粒，根据磁珠成分主要包括Fe3O4和γFe2O3。相比传统载体材料，基于纳米磁珠构建的信号传感器具有良好的生物相容性、超顺磁性、巨大的比表面积等特点[16, 17]，可作为载体为生物分子固定提供良好的介质。同时在纳米磁珠表面可修饰不同活性基团，利用生物探针特异性识别以捕获微量颗粒或连接其他纳米材料颗粒。与其他分离技术例如色谱分离、离心和基于膜的分离相比[18, 19]，基于纳米磁珠构建的生物传感器可提供高吞吐量、低成本、快速和简化的操作[2022]，同时保证了生物活性，因此广泛应用于微量物质检测。
金属纳米颗粒如Au、Ag、Cu等是一种尺度在纳米量级的微观颗粒，具有一系列独特的理化性质。因其具有表面等离子体共振（SPR）光学特性—SPR是由于与可见光区域中的入射光共振而发生自由电子的集体振荡的现象，广泛应用于可视性检测[23]。利用金属纳米颗粒构建传感器芯片，可大大增强拉曼散射信号，实现各种生物分子实时、原位和动态检测。金纳米粒子因具有较好的导电能力，能够起到纳米导线或者导电通道的作用，常用于加速生物分子电子转移、增加氧化还原物表面反应可逆性、加快异相界面电子传递速率等[24]。通过将生物识别元件连接到纳米金粒子表面，构建纳米金信号放大体系，可实现低浓度生物相关分子的检测。此外，通过构建纳米复合材料，可比单一性纳米粒子更容易形成连续的势场，使得表面电子的迁移速率加快，从而使得检测体系灵敏性更加优异。

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