流感病毒是可感染各种鸟类、哺乳动物以及人类的重要人畜共患病病原，能够引起宿主急性呼吸道疾病，严重威胁着养殖业的发展和人类的健康。2011年，在猪的呼吸道中发现了正粘病毒科的新型成员，即D型流感病毒（Influenza D virus, IDV）。我们进行了IDV HEF基因的遗传进化分析，系统发育树显示D型流感病毒有三个独立的分支D/swine/Oklahoma/1334/2011（D/OK）, D/bovine/Oklahoma/660/2013（D/660）, D/bovine/Ibaraki/7768/2016（D/Japan）。迄今为止，还没有基于质粒拯救D型流感病毒的反向遗传系统报道。本课题成功构建了D型流感病毒基因组转录载体和用于表达病毒蛋白的表达载体。将构建好的质粒共转染到人胚胎肾细胞（293T）中，初步尝试了D型流感病毒的拯救，虽未获得具有感染性的病毒粒子，但为D型流感病毒的进一步研究奠定了基础。
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言4
1 材料与方法5
1.1 材料 5
1.1.1 细胞株、菌株5
1.1.2 载体和主要试剂5
1.2.3 引物5
1.1.4 主要仪器和耗材5
1.2 方法 6
1.2.1 IDV HEF基因遗传进化分析6
1.2.2 PCR扩增D型流感病毒基因片段6
1.2.3 PCR产物的核酸电泳鉴定7
1.2.4 DNA目的片段胶回收7
1.2.5 目的片段的限制性酶切反应7
1.2.6 酶切产物的纯化7
1.2.7 基因片段与载体的连接反应7
1.2.8 感受态DH5α的制备7
1.2.9 连接产物转化感受态细胞7
1.2.10 挑菌、摇菌8
1.2.11 阳性克隆的菌液PCR鉴定8
1.2.12 阳性克隆的菌液保种8
1.2.13 阳性质粒的提取 8
1.2.14 质粒的测序鉴定8
1.2.15 293T细胞 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
的准备8
1.2.16 质粒转染与病毒拯救9
1.2.17 感染HRT18G、ST细胞增殖病毒9
1.2.18血凝实验9
2结果与分析10
2.1 D型流感病毒HEF基因遗传进化分析10
2.2 D/bovine/Shandong/Y125/2014毒株反向遗传系统载体的构建12
2.2.1 D型流感病毒转录载体的构建12
2.2.2 D型流感病毒表达载体的构建12
2.3 D型流感病毒的拯救12
3 讨论 13
3.1 D型流感病毒HEF基因遗传进化分析13
3.2 D型流感病毒反向遗传系统载体的构建13
3.3 D型流感病毒的拯救14
致谢14
参考文献15
D型流感病毒反向遗传系统感染性克隆的构建
引言
2011年，在美国中西部地区，从流感样症状的临床病猪中分离出类似C型的流感病毒[1]。随后，从美国、墨西哥、亚洲（中国、日本）和欧洲（法国、意大利）等其它地区分离出一种非常相似的病毒[25]。系统进化发育分析显示，这些毒株与人类C型流感病毒（Influenza C virus, ICV）的总氨基酸同源性仅为50％，分枝位于A型流感病毒（Influenza A virus, IAV）和B型流感病毒（Influenza B virus, IBV）之间。此类病毒与人ICV抗血清之间没有观察到交叉反应性，并且表现出一种产生M1蛋白的新机制，不能与人类ICV重组产生可增殖的子代[6]。基于与ICV的这些差异，该病毒被国际病毒学分类委员会（ICTV）归类为正粘病毒科流感病毒属的新型病毒，称为D型流感病毒（Influenza D virus, IDV）。几项研究调查了猪、牛、人和小反刍动物中IDV的流行病学[79]，在猪血清样品中，红细胞凝集抑制测定中的血清阳性率低（9.5％），表明病毒在猪中循环，但不普遍流行。牛中IDV的流行率较高，特别是犊牛。约95％的新生小牛具有高水平的母体抗IDV抗体,随后在接下来的六个月内减少，导致IDV的易感性增加。普通人群的血清阳性率只有1.3%，而从事牛养殖相关工作人员的血清阳性率高达95％。绵羊血清阳性率为5.2％，山羊为8.8％。到目前为止，根据流行病学，血清学和病理学研究，牛被认为是IDV的主要天然储存宿主[10]。IDV是否能导致人类疾病，是否可以在人群中传播并对公共卫生产生威胁目前尚未可知。
为了解国内外D型流感病毒流行趋势和抗原分化状况，本研究基于D型流感病毒HEF基因片段，进行了遗传进化分析。在此基础上，本研究构建了D型流感病毒的反向遗传操作系统，使用带有BsmBI限制性酶切位点的引物通过PCR扩增D/bovine/Shandong/Y127/2014流感病毒7个cDNA片段，并克隆到含有人RNA聚合酶I启动子和小鼠RNA聚合酶I终止子的pHH21载体上[11]。编码D/bovine/Shandong/Y127/2014病毒的7个基因的编码区（coding sequence, CDS）序列克隆到真核表达载体pCAGGS 上。将构建好的vRNA转录载体（pHH21PB2; pHH21PB1; pHH21P3; pHH21HEF; pHH21NP; pHH21P42和pHH21NS）和蛋白表达载体（pCAGGSPB2; pCAGGSPB1; pCAGGSP3; pCAGGSNP; pCAGGSHEF; pCAGGSP42以及pCAGGSNS）共转染到人胚胎肾细胞（293T）上，进行D型流感病毒的拯救，随后在猪睾丸细胞（ST）和人直肠癌细胞（HRT18G）上增殖病毒。为D型流感病毒的生物学特性、基因组结构与功能的关系等方面的研究奠定了基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 细胞株、菌株 人胚肾细胞(HEK293T)，猪睾丸细胞（ST）均由本实验室保存，人直肠癌细胞（HRT18G）购自ATCC，货号：Crl11663，SPF鸡胚，大肠杆菌DH5α。

原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/dwyx/562194.html