绵羊肺炎支原体（MO）和小反刍兽疫病毒（PPRV）都可以造成山羊和绵羊的呼吸系统疾病，二者常呈现混合感染，给我国畜牧养殖产业户产生了很大的经济损失。本次研究的目的是建立针对绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒的双重RT-PCR检测方法。针对MO和PPRV基因设计合成两对特异性引物，通过退火温度和引物浓度的优化、特异性和灵敏性检测，建立了双重RT-PCR，结果显示能特异性的扩增MO（359bp）和PPRV（686bp）基因片段，其特异性较好，结果对MO和PPRV的最小检出量分别为103拷贝/μL和102拷贝/μL。部分临床样品检测结果显示，该方法可有效检测这两种病原。综上，本研究建立的双重 RT-PCR方法具有高特异性和敏感性，可用于MO和PPRV的临床快速诊断。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1菌株和毒株 2
1.1.2试剂 2
1.1.3仪器 2
1.2方法 3
1.2.1引物设计与合成3
1.2.2待测样本DNA/RNA提取3
1.2.3 MO和PPRV目的基因的扩增3
1.2.4 PCR产物的回收纯化4
1.2.5目的片段的克隆5
1.2.6质粒的提取5
1.2.7重组质粒的鉴定6
1.2.8双重RTPCR目的片段的扩增6
1.2.9双重RTPCR 反应条件的优化7
1.2.10双重RTPCR特异性实验7
1.2.11双重RTPCR敏感性实验7
1.2.12临床样品检测8
2 结果与分析8
2.1 MO和PPRV目的基因的扩增8
2.2 重组质粒鉴定8
2.3双重RTPCR目的片段的扩增9
2.4双重RTPCR反应条件的优化9
2.4.1引物浓度优化9
2.4.2退火温度优化10
2.5双重RTPCR特异性实验10
2.6双重RTPC *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
R敏感性实验11
2.7临床样品检测11
3讨论12
致谢13
参考文献14
绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒双重RTPCR方法的建立
引言
小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petis ruminants virus, PPRV)引起的一种具有高度快速传染性的动物病毒性疾病[1]。PPRV属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morboli virus) [2]易感动物主要是小反刍兽如山羊和绵羊。截止当前，PPR是世界动物卫生组织(OIE)列出的一定要向兽医防控部门通报的动物传染病（OIE.2016）,是我国农业部《一、二、三类动物疫病病种名录》中规定的一类动物疫病名单中的疾病[3]，截止目前没有感染人的报道。小反刍兽疫可使小反刍动物发生发热、眼和鼻都出现许多分泌物、肺炎、上消化道溃疡糜烂和腹泻等主要临床症状(Griffin et al.2009)。PPRV 主要感染幼年的绵羊和山羊，感染率和死亡率可以达到85%之高 [4]。中国的第一例 PPR 病例发现于 2007 年的西藏[5]，在之后国家进行严格控制措施和战略监督，疫情得到消除。2013年底PPR疫情再次出现，在我国从新疆等地向其他地区快速传播，我国多个省区均有PPR疫情出现[6] [7]。小反刍兽疫一旦出现后就会快速传播，跨度范围也很大，动物感染疾病的风险特别高，这就给我国动物疫病的防控工作造成了巨大的威胁。
绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）是造成羊支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of sheep）的一种重要病原体，在临床表现的主要的特征是发高热稽留热、咳嗽、流涕、同时出现肺炎和胸膜炎，过程发生多取急性或慢性，有很高的病死率，可对养殖羊业造成很大的损失。MO于 1963 年初次由 Mackay在英格兰从患病的绵羊体内分离得到，并由 Carmichael 等命名 [8]。绵羊支原体肺炎约有 25%的发病率和30%的病死率 [9]，呈全球性分布，多流行于中东、东亚、澳洲等养羊业较为集中的国家[10]。在我国，自 1982 年胡景韶等首次分离到 MO以来[11]，多个省份也分离到该病原体。绵羊肺炎支原体流行广泛，致病力强，对我国乃至世界养殖业均造成巨大危害。
支原体分离培养和病毒分离是检测病原的常用方法，但考虑到此方法其费时费力，对实验室安全要求很高，而且更重要的是绵羊肺炎支原体在体外培养环境要求严格，生长相对来说比较缓慢，营养要求又比较高，而且容易造成污染导致病原分离失败，小反刍兽疫作为一类疫病不具备分离的条件。这给这两种病原的快速诊断带来困难。MO在全球范围内均有分布, PPRV自2014年传入国内多数省区后危害巨大，二者均为引起山羊呼吸道疫病的主要病原，临床上经常存在混合感染的情况发生，因此正确有效的诊断对疾病的防控有重要意义。目前对于绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒，都已经分别建立了分子生物学方法特异的PCR或RTPCR方法，这种方法可以广泛的应用在对这病原的检测、诊断和流行病学统计调查方面［12，13］，但是，同时检测MO和PPRV的RTPCR方法尚未有报道。
1 材料和方法
1.1材料
1.1.1菌株和毒株
山羊支原体（PG3株）、MO（Y98株）、丝状支原体（F38株）从中国兽医药品监察所购入；PPRV弱毒苗（PPRV Nigeria 75/1株）从新疆天康畜牧生物技术股份有限公司购入；蓝舌病毒（BTV）[14]、牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型[15]和Ⅱ型[16]、边界病病毒（BDV）[17]、山羊副流感Ⅲ型[18]、山羊疱疹病毒Ⅰ型（CpHV1）[19]由江苏省农业科学院兽医研究所分离保存；山羊痘病毒(“痘必应”山羊痘活疫苗)购自哈药集团生物疫苗有限公司。
1.1.2试剂
限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ、10×K buffer、pMD18T载体购自大连TaKaRa公司; DH5α感受态细胞、Trans Zol UP一步法RT PCR试剂盒、Taq DNA聚合酶均从北京全式金生物技术有限公司购入；用于提取DNA/RNA、质粒的试剂盒和回收琼脂糖凝胶的成品试剂盒均从Axygen公司购入；Premix TaqTM、DL2000plus Marker等均为大连宝生物工程有限公司产品；核酸染料Goldview从BioTekeCorporation购入；10×PCR buffer、10mmol/L dNTP Mix和凝胶加样缓冲液6×Loading Buffer均购自Prmogea公司。

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