本研究主要对2017年与2018年收集到的3760份奶牛乳房炎奶样进行病原分离鉴定，对分离鉴定到的金黄色葡萄球菌使用多位点序列分型（MLST）和蛋白A基因多态性（spa）分型两种方法进行分型，研究致奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的流行变化和趋势；通过使用微量肉汤稀释法，检测分离到的金黄色葡萄球菌对苯唑西林的耐药性，使用PCR方法检测有关的耐药基因mecA与mecC，筛选牛源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。经过试验研究，致奶牛乳房炎的主要致病菌分离到8种，金黄色葡萄球菌95株（8%），无乳链球菌80株（7%），停乳链球菌58株（5%），乳房链球菌135株（12%），肺炎克雷伯290株（25%），溶血性凝固酶阴性葡萄球菌100株（9%），牛棒状杆菌11株（1%），大肠杆菌387株（33%）；多位点序列分型结果共测得已知ST型26种，其中19种为已知的ST型，7种新的ST型，检出率最高的分别是ST1（25， 22%）、ST97 (22， 19%)、 ST705 (19，17%)；spa分型结果共发现30种spa型，其中t114型是最多的，共有24株，占比21.05%，其次是t529，22株，占比19.30%，除此之外，还有t267（7.89%），t189（6.14%），t4167（4.39%）等；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌筛查显示有四株分离株苯唑西林耐药阳性，分别命名为WH2018070679（ST705、t529）、HHHT2018072285（ST1、t114）、BT2017082135（ST1、t114）、HB20181220116（新的ST、t437），一株分离株为mecA基因阳性为HB20181220116（新的ST、t437）。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料与方法4
1.1试剂与仪器 4
1.2方法 4
1.2.1奶样中致病菌分离鉴定4
1.2.2金黄色葡萄球菌基因组的提取4
1.2.3多位点序列分型（MLST）5
1.2.4蛋白A基因多态性（SPA）分型5
1.2.5耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的筛选6< *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
br /> 1.2.6耐药基因mecA与mecC基因检测6
2结果与分析6
2.1乳房炎致病菌分离鉴定结果6
2.2金黄色葡萄球菌MLST结果7
2.3金黄色葡萄球菌spa分型结果7
2.4MRSA筛选结果9
2.5耐药基因mecA与mecC扩增结果10
3讨论 10
3.1乳房炎致病菌分离鉴定10
3.2金黄色葡萄球菌MLST10
3.3金黄色葡萄球菌spa分型10
3.4MRSA筛选11
致谢11
参考文献11
奶牛乳房炎致病菌的分离鉴定及致奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌分子分型及MRSA筛查
引言
奶牛乳房炎是影响奶业发展的一个重要原因，导致奶牛乳房炎的原因众多，有细菌、病毒、支原体以及奶业人员操作导致的等等原因[1]。本研究统计了2017年和2018年两年中收集的奶样中致病菌的分离鉴定情况，探索奶牛乳房炎致病菌的流行情况及分布情况。在奶牛乳房炎致病菌中，金黄色葡萄球菌是一直引起人们极大关注的一种人畜共患病病原，除了引起奶牛乳房炎对养殖业造成巨大经济损失，它还可以引起人的关节炎、脑膜炎及败血症等多种疾病，严重时引起死亡，另一类是毒素性疾病，被葡萄球菌污染的食物或者私聊引起人或者动物的中毒性呕吐、肠炎及人的毒素休克综合征等[2， 3]。此外，金黄色葡萄球菌还因为其易产生耐药性而对临床治疗预防产生极大的影响。1961年，英国首次证实了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的存在，此后，临床上MRSA 菌株的检出率逐年增长[4]。本研究使用多位点序列分析（MLST）分型与蛋白A基因多态性（spa）分型方法对致奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌进行分子分型研究，检测致奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的流行趋势，其次，对金黄色葡萄球菌进行甲氧西林耐药性的筛查，检测致奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌中是否有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的分布及比例。金黄色葡萄球菌对甲氧西林类药物耐药的机制有多种，其中mecA是传播最为广泛的耐药基因，但除了mecA，人们还发现存在同源基因mecC[57]同样介导了金黄色葡萄球菌对甲氧西林的耐药性，以及其他多种机制[8]。检测有关耐药基因可以研究其耐药机制的可能性。
1 材料与方法
1．1 试剂与仪器
菌株：金黄色葡萄球菌ATCC25923和ATCC25921购自美国菌株保存中心；两株猴源金黄色葡萄球菌，两株鸭源金黄色葡萄球菌，两株猪源金黄色葡萄球菌均由江苏省出入境检疫局馈赠。
试剂：THB培养基（美国BD公司）；Green Taq Mix（诺唯赞生物公司）；16s DNA引物（金斯瑞公司）；金黄色葡萄球菌MLST 7对管家基因引物、SPA引物、mecA基因引物、mecC基因引物（金斯瑞公司）；苯唑西林钠（源叶生物）；细菌基因组提取试剂盒（大连宝生物工程公司）。
仪器：电子天平（Sartorius），恒温培养箱（Thermo），离心机（Beckman Coulter），核酸电泳仪（南京科宝仪器研究所），显微镜（日立），PCR仪（BIORAD）
1．2 方法（黑体小四号）
1．2．1 奶样中致病菌分离鉴定[9] （1）划线分离 取无菌棉签一只，蘸取适量奶样，涂布于鲜血琼脂培养基和麦康凯培养基的二分板上，置于37℃温箱中培养24 h。
（2）分离纯化及染色 观察平板中细菌生长情况并记录菌落形态、大小、颜色、数量及溶血情况。根据记录结果，挑选单个目的菌落至10%胎牛血清的THB培养基中，置于37℃恒温震荡仪中培养12 h。同时挑选单个目的菌落至无菌载玻片上，使用ddH2O稀释涂布，酒精灯火焰固定后，革兰染色镜检观察细菌形态。
（3）细菌DNA粗提 根据镜检结果，革兰阴性菌5000 rpm，5 min离心，弃上清，100℃水浴510 min，5000 rpm，5 min离心，取上清；革兰阳性菌5000 rpm，5 min离心，弃上清，加入50 μL溶菌试剂，静置2 min，100℃水浴510 min，5000 rpm，5 min离心，取上清。
（4）PCR扩增测序 使用粗提样品DNA为模板，进行PCR扩增，使用细菌16SrRNA通用引物进行扩增，引物序列为F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；R：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA，产物长度为1300~1500 bp。40 μL反应体系为：Green Taq Mix，20 μL；27F，2 μL；1429R，2 μL；ddH2O，14 μL；细菌基因组，2 μL。反应条件为：95℃预变性5 min；95℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 90 s，30个循环；72℃延伸10 min。样品送往测序公司进行测序，测序结果与https://www.ncbi.nlm.9nih.gov/网页数据库进行比对，得出测序结果。

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