肉羊肌肉发育直接关乎产肉性能，研究显示DNA甲基化在肌肉生长发育过程中发挥重要的作用，但具体的作用机制仍不明确。本课题前期通过WGBS及RNA-seq对110 d胎龄和2岁湖羊的背最长肌进行全基因组甲基化分析。为进一步验证测序结果的准确性及与肌肉生长发育相关基因的表达水平，本课题以110d胎羊和2岁湖羊的背最长肌为研究对象，通过重亚硫酸氢盐测序及荧光定量PCR验证测序结果并分析与肌肉发育相关基因的表达水平。结果表明胎羊组和成年羊组间的基因表达存在差异FSTL1、DLK1、COL14A1、FADS2、KLHL31、NDUFV3基因表达差异极显著(P<0.01)，REEP5基因表达量差异显著(P<0.05)。其中，FSTL1、DLK1、COL14A1、FADS2下调，KLHL31、NDUFV3、REEP5上调。重亚硫酸氢盐测序表明在胎羊时期和成年羊时期的肌肉组织中，DLK1基因甲基化水平分别为61.12%和75.81%， FADS2为54.42%和63.35%，RTL1为47.77%和84.7%， KLHL31为69.67%和59.4%。与胎羊相比，DLK1、FADS2、RTL1的甲基化水平上升，KLHL31的甲基化水平下降，试验结果与测序结果一致，表明测序得到的结果可靠，为进一步研究靶基因在肌肉发育中的作用与机制奠定了理论基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1试验动物2
1.1.2试验试剂及耗材2
1.1.3试验主要仪器及设备2
1.2方法 2
1.2.1实时荧光定量PCR2
1.2.2重亚硫酸氢盐测序PCR 5
1.2.3数据处理与统计分析6
2结果与分析6
2.1 qRTPCR验证测序结果6
2.2重亚硫酸氢盐测序PCR结果7
3讨论9
致谢11
参考文献12
湖羊肌肉发育关键阶段DNA甲基化测序结果的验证
引言
我国肉羊种质资源丰富，是世界第一肉羊养 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
殖大国。然而，我国肉羊均为地方品种，普遍存在着生长速度慢、出栏体重轻、屠宰率低等产肉性能不高的问题[1]，是规模化舍饲养羊提质增效面临的重要瓶颈。因此，提高产肉性能是当前肉羊生产中要解决的重大课题之一。湖羊是重要的经济用家畜之一，也是我国的保护性地方品种。是我国少有的白色羔皮羊品种，具有一年二胎、四季发情、每胎多羔、泌乳性能好、生长发育快、改良后产肉性能理想、耐高温高湿等优良性状，是重要的绵羊品种，具有巨大的商业价值。肌肉组织是动物机体的重要组成部分，骨骼肌则是三大肌肉组织中最主要的一种，不仅在动物运动、器官的形态、产热、保护等方面起着重要作用，而且与肉畜的肉产量与品质紧密相关。骨骼肌的生长发育是成肌细胞增殖、融合并分化成肌纤维的过程，这些过程除了受基因型影响以外，还受到表观遗传因素的复杂调控。研究显示，在肌肉生长发育过程中，DNA甲基化作为表观调控机制，发挥了重要的作用[2]，但具体的作用及调控机制仍不明确。前期研究通过WGBS及RNAseq对110d胎龄和2岁湖羊的背最长肌进行全基因组DNA甲基化分析，为进一步验证测序结果的准确性及与肌肉生长发育相关基因的表达水平。为此，本课题以110d胎羊和2岁湖羊背最长肌为研究对象，通过重亚硫酸氢盐测序（BSP）及qRTPCR验证测序结果并分析与肌肉发育相关基因的表达水平，为进一步研究靶基因在肌肉发育中的作用及机制奠定了理论基础，对研究肌肉形成与发育的分子调控机制具有重要的意义。
1 材料与方法
1．1 试验材料
1．1．1 试验动物
选取110 d胎羊与两岁成年湖羊(公)各3只，屠宰后切取其背最长肌，使用生理盐水将残留的血液冲洗干净，然后用75%的酒精处理过的手术刀片切取适量大小的肌肉组织，用纱布包好，做好标记，投入液氮瓶中妥善保存，带回实验室，放到液氮罐中冷冻保存备用。本试验中使用的湖羊均采自泰州海伦羊业有限公司。
1．1．2 试验试剂及耗材
Trizol 试剂（Invitrogen公司）
普通PCR试剂盒（2×Taq PCR Master Mix，南京博尔迪）
反转录试剂盒 （TaKaRa; No. RR047A）
荧光定量试剂盒（TaKaRa; No.DRR820A）
EZGold DNA甲基化试剂盒（ZYMO RESEARCH, USA）
1．1．3 试验主要仪器及设备
实时荧光定量PCR仪（Life Technologies，USA）
PCR扩增仪（大连宝生物工程有限公司，PCR Thermal Cycle）
琼脂糖凝胶电泳仪和电泳槽（北京六一，DYY6C和DYCP32A）
全自动数码凝胶成像系统（Tanon, Tanon4100）
离心机（Centrifuge，德国）
1．2 试验方法
1．2．1 实时荧光定量PCR
(1) 对湖羊肌肉组织进行RNA提取，使用Trizol法，步骤如下：
① 试验前期准备：将整个过程中将用到的所有耗材进行灭菌、消毒和去RNA酶污染处理，其中玻璃制品分别在酸液和浓度1%的焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonate, DEPC)水中充分浸泡，使用高压灭菌锅高压后烘干待用；塑料制品同样置于1%DEPC水浸泡过夜后，高压、烘干后待用。
② 匀浆处理：将0.1 g肌肉组织在液氮中磨碎，加入500 μL Trizol，使用匀浆仪进行充分匀浆，时间可为35 min，充分匀浆后需要再补加500 μL Trizol。注：为保证匀浆仪洁净，每次更换样品时都需要用去离子水清洗匀浆仪，匀浆后的样品在室温（1530℃）条件下静置5 min，使核酸蛋白质复合物完全分离。
③ 分离：向离心管中加入200 μL氯仿，进行15 s的剧烈震荡，室温下放置3 min。随后在离心机里采用28℃12000 rpm 离心15 min；管内液体会分离成三层：下层是黄色的有机相，上层是无色水相，中间层介于二者之间，目的RNA主要会溶解在水相中。
④ RNA沉淀：提前准备好1.5 mL的干净离心管，在离心结束后，吸取离心管管内水相到新管中，再加入500 μL 异丙醇，将管上下颠倒，抖动使液体混匀，室温下静置10 min，然后在28℃，10000 rpm的条件下离心10 min，然后弃掉上层液体，向残余的沉淀物中加入浓度75%的乙醇（用DEPC水稀释），如前面方法，上下颠倒充分洗涤离心管，在28℃，不超过7500 rpm的条件下再次离心5 min，去掉上清。室温放置510 min使其干燥。

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